SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2344—2014 代替SN/T2344—2009 黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of cucumber green mottle mosaic virus 行业标准信息服务平台 2014-11-19发布 2015-05-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2344—2014 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准代替了SN/T2344—2009《黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法》。 本标准与SN/T2344一2009相比，主要技术变化如下： 增加了“实时荧光定量RT-PCR方法”和“快速免疫层析检测” 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检 疫局。 本标准主要起草人：陈青、梁新苗、黄峰、廖富荣、陈细红、陈红运、林石明。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： SN/T2344—2009。 行业标准信息服务平台 1 SN/T2344—2014 黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法 1范围 本标准适用于可能带有黄瓜绿斑驳花叶病毒的植物的种子、苗木及植物产品的检疫鉴定。 2 黄瓜绿斑驳花叶病毒基本信息 学名:cucumber green mottle mosaic virus 缩写：CGMMV 分类地位：烟草花叶病毒属（Tobamovirus）的成员 CGMMV通过机械传播，也通过种子传播。嫁接等农事操作是田间病害流行的主要因素之一， CGMMV还可以经Cuscutasubinclusa，啤酒花苑丝子（C.lupuliformis）和C.campestris传毒，植株一 日发病，如果未进行杀灭处理，土壤也可带毒，带毒土壤也可成为病害发生的侵染源。 详细资料参见附录A。 3方法原理 根据黄瓜绿斑驳花叶病毒与抗体之间的特异性反应，对瓜类叶片或种子进行ELISA检测；根据该 病毒基因组特性进行PCR特异性检测，通过电泳条带大小进行结果判定。 4仪器设备与试剂 4.1 仪器设备和用具 微量研磨仪、酶标仪、洗板机、微量天平（感量：0.001g）、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪 高速冷冻台式离心机、水浴槽、pH计、移液器（1000L、200μL、20uL、2μL）、96孔酶标板、研钵等；防 虫温室。 4.2试剂 5检测样品的制备 5.1种子样品制备 挑取畸形、不成熟种子播于灭菌土中，待长出3～4片叶后将表现症状的植株编号，未表现症状的植 株分组（10株为1组）并编号，采集的叶片分成2份，根据需要分别用于后续的试验。 也可以挑取畸形、不成熟的种子直接进行酶联测定和分子生物学检测。 1 SN/T 2344—2014 5.2苗木 和检测方法同5.1。 5.3植物产品 植物产品有症状的部分（如：叶片畸形、花叶、斑驳等）单独编号检测。没有症状或无法观察症状的 植物产品，应按比例取样，分组编号，分组方法和检测方法同5.1。 6检测与鉴定 6.1双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA） 检测样品一致。不同的检测试剂或试剂盒根据试剂或试剂盒的说明操作。具体操作见附录B。 6.2RT-PCR检测 分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后，进行PCR扩增。健康的植物组织作阴性对 照，感染CGMMV的植物组织作阳性对照，用超纯水作空白对照。具体操作见附录C。 6.3实时荧光定量RT-PCR检测 分别提取样品和对照的总RNA，进行实时荧光定量RT-PCR实验。健康的植物组织作阴性对照， 感染CGMMV的植物组织作阳性对照，用超纯水作空白对照。具体操作见附录D。 6.4快速免疫层析检测 取待检测叶片按1：10（质量：体积）加入PBS缓冲液，匀浆，离心，将黄瓜绿斑驳花叶病毒免疫层 析试纸条有箭头的一端插人样品溶液中，观察。具体操作见附录E。 6.5 5免疫电子显微镜观察 具体操作参见附录F。 6.6生物学接种检测 具体操作参见附录G。 7结果判定 如果其中2种方法检测结果为阳性，即可判断该批样品携带黄瓜绿斑驳花叶病毒。一般是酶联测 定为阳性后，RT-PCR检测为阳性即可判断为样品携带黄瓜绿斑驳花叶病毒。 8结果记录与样品保存 8.1结果记录 完整的实验记录包括：样品的来源、种类，时间，实验的时间、地点，方法和结果等，并要有经手人和 2