(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111470548.9 (22)申请日 2021.12.0 3 (71)申请人 深圳先进技 术研究院 地址 518055 广东省深圳市南 山区西丽 街 道大学城学苑大道1068号 申请人 中国科学院深圳理工大 学 （筹） (72)发明人 陈有海　郑植元　 (74)专利代理 机构 深圳五邻知识产权代理事务 所(普通合伙) 44590 专利代理师 王策 (51)Int.Cl. C07K 19/00(2006.01) C12N 15/867(2006.01) C12N 5/10(2006.01) A61K 39/00(2006.01)A61P 35/00(2006.01) A61P 35/02(2006.01) (54)发明名称 一种靶向实体瘤的CAR-T细胞的构建方法和 应用 (57)摘要 本发明属于免疫治疗技术领域， 公开了一种 在实体瘤中激活的靶向实体瘤特异性高表达膜 蛋白的CAR ‑T细胞及其构建方法与应用。 所述CAR 结构对应的DNA序列含有实体瘤缺氧微环 境可激 活的启动子， 所述启动子由HIF ‑1可结合的缺氧 反应元件 连接构成， 所述缺氧反应元件的重复数 为3‑5个。 所述CAR结构对应的DNA序列在启动子 下游含有CA9、 GLUT ‑1或MCT4等蛋白的抗体对应 的基因， 可以在T淋巴细胞到达实体瘤时将相应 的CAR高效表达于细胞膜上， 因此能够在实体瘤 缺氧微环境中激活CAR ‑T细胞， 增强CAR ‑T细胞靶 向实体瘤的治疗作用， 使其具有更广阔的临床应 用前景。 本发明为CAR ‑T细胞用于实体瘤治疗提 供了一种新的思路和策略。 权利要求书2页 说明书5页 附图1页 CN 114671957 A 2022.06.28 CN 114671957 A 1.一种靶向实体瘤特异性高表达膜蛋白的嵌合抗原受体(CAR)， 其特征在于， 所述CAR 包括： 抗原结合结构域、 跨膜结构域和胞内结构域， 其CAR结构如下式I所示： X1‑ScFv‑H‑TM‑CS‑X2   (I) 式中， 所述“‑”为连接肽或肽键； X1为无或信号肽序列； ScFv为CAR的胞外段或靶向肿瘤抗原配 体的抗体单链可变区序列； H为铰链区； TM为跨膜结构域； CS为共刺激信号分子； X2为源于 CD3ζ 的胞浆信号传导序列； 所述CAR结构对应的DNA序列含有实体瘤缺氧微环境可激活的启动子； 所述启动子由 HIF‑1结合的缺氧反应元件连接构成， 所述缺氧反应元件的重复数为3 ‑5个， 其后连接迷你 启动子。 2.根据权利要求1所述的靶向实体瘤特异性高表达膜蛋白的CAR， 其特征在于， 所述缺 氧激活的启动子的核心核酸序列为5 ′ ‑RCGTG‑3′， R代表A或者G。 3.根据权利要求1 ‑2任一项所述的靶向实体瘤特异性高表达膜蛋白的CAR， 其特征在 于， 所述ScFv为CAR结构的抗原识别区； 所述抗原识别区所识别 的抗原为AXL、 CA9、 CD39、 CD47、 CD73、 CD274(PDL1)、 L1CAM(CD171)、 MCT4、 MET、 NHE1、 PLAU R(uPAR)、 GLUT ‑1(SLC2A1)、 SLC7A11、 GLUT‑3、 MET中的任意 一项或多 项。 4.一种包含表达权利要求1 ‑3任意一项所述CAR的表达载体， 其特征在于， 所述表达载 体为慢病毒表达载体、 逆转录病毒表达载体、 腺病毒表达载体、 腺相关病毒表达载体、 单纯 疱疹病毒载体、 DNA载体、 RNA载体、 质粒中的任一种。 5.根据权利要求 4所述的CAR的表达载体， 其特 征在于， 其表达载体具有以下 结构： 5HRE—CMV—CD8—ScFv—CD 8H—CD8TM—4‑1BB—CD28‑CD3ζ 。 6.一种靶向缺氧实体瘤的CAR ‑免疫细胞， 其特征在于， 其CAR为权利要求1 ‑5任一项所 述的CAR； 所述免疫细胞为 NK细胞或T细胞。 7.一种制备权利要求6任一项所述的靶向缺氧实体瘤的CAR ‑免疫细胞的方法， 其特征 在于， 包括如下步骤： 1)提供一待改造的免疫细胞； 2)对所述的免疫细胞进行改造， 从而使得所述的免疫细胞表达权利要求1 ‑3任意一项 所述CAR。 8.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述的方法还包括对获得的工程化免疫细 胞进行功能和有效性检测的步骤。 9.权利要求1 ‑3任一项所述的CAR和/或权利 要求4‑5任一项所述的表达载体和/或权利 要求6所述的CAR ‑免疫细胞和/或权利要求7所述的方法制备的CAR ‑免疫细胞在制备治疗肿 瘤的药物中的应用。 10.根据权利要求9所述的应用， 其特征在于， 所述肿瘤包括血液系统肿瘤和实体瘤， 所 述血液系统肿瘤 包括但不限于急性淋巴样白血病、 慢性淋巴细胞白血病、 慢性髓性白血病、权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114671957 A 2弥漫性大B细胞淋巴瘤、 多发性骨髓瘤、 非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤； 所述实体瘤包括 但不限于前列腺癌、 肝癌、 头颈癌、 黑色素瘤、 非霍奇金淋巴瘤、 膀胱癌、 胶质母细胞瘤、 宫颈 癌、 肺癌、 软骨肉瘤、 甲状腺癌、 肾癌、 间皮瘤、 骨肉瘤、 胆管癌、 卵巢癌、 胃癌、 脑膜瘤、 胰腺 癌、 多发性鳞状细胞瘤、 食 管癌、 肺小细胞癌、 结直肠癌、 乳腺癌、 成神经管细胞瘤、 脑癌和皮 肤癌。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114671957 A 3