ICS65.120 B46T/SDAQI 团 体 标 准 T/SDAQI038—2021 饲料中氢溴酸常山酮的测定液相色谱-串 联质谱法 Determinationofhalofuginonehydrobromideinfeedbyliquidchromatography- tandemmassspectrometricmethod 2021-09-25发布 2021-10-25实施 山东质量检验协会  发布 全国团体标准信息平台 T/SDAQI038—2021 I版权说明 本文件系由山东质量检验协会（简称“协会”）组织创制的团体标准文本（含制定过程中的草案）， 协会拥有本文件的著作权，受《中华人民共和国著作权法》保护。除法律所允许的情形或事先得到协会 书面许可外，任何组织和个人不得以任何理由进行复制、销售、传播本文件，或抄袭、歪曲本文件等侵 权行为，否则，行为人应承担相应的民事、行政责任，构成犯罪的，将依法追究其刑事责任。其他文件 引用本文件，不属侵权行为。 凡利用本文件进行或支持贸易、认证等商业活动，应事先购买正式文本或得到协会书面授权。购买 本文件或获得授权，请与协会联系。 欢迎社会各界举报侵权盗版行为，协会将依法严格保护举报人信息。 联系人：范红梅 联系电话：0531-8970198615668365153 联系邮箱：[email protected] 协会对本版权声明拥有最终解释权。 全国团体标准信息平台 T/SDAQI038—2021 II前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由山东质量检验协会提出并归口。 本文件起草单位：山东省产品质量检验研究院、山东省农村信用社联合社、青岛市食品药品检验研 究院、滨州市食品药品检验检测中心。 本文件主要起草人：侯广月、刘丽洁、李法杰、赵海峰、周莉莉、姚傲男、徐志娇、康兆广、杜营、 李大为、卞英芳、王颖臻、韩岩君、李杜慧、颜士忠。 本文件的所有权和解释权归山东质量检验协会。 如果您在本文件使用中发现错误或技术内容有不当之处，请及时与协会秘书处联系，将意见发送到 [email protected]。 全国团体标准信息平台 T/SDAQI038—2021 1饲料中氢溴酸常山酮的测定液相色谱-串联质谱法 1范围 本文件规定了饲料中氢溴酸常山酮的液相色谱-串联质谱测定方法。 本文件适用于配合饲料、浓缩饲料、预混合饲料中氢溴酸常山酮的测定。 本文件的方法定量限为1 μg/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T20195动物饲料试样的制备 3术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4原理 试样用酸化的乙腈提取，用乙腈饱和正己烷除脂净化后，采用液相色谱-串联质谱仪测定，外标法 定量。 5试剂或材料 除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的一级水。 5.1试剂 5.1.1甲醇（CH3OH）：色谱纯。 5.1.2乙腈（CH3CN）：色谱纯。 5.1.3正己烷（C6H14）：色谱纯。 5.1.4乙酸铵（CH3COONH4）：色谱纯。 5.1.5甲酸（HCOOH）：色谱纯。 5.2试剂配制 5.2.1乙腈饱和正己烷：取200 mL正己烷于250 mL分液漏斗中，加入适量乙腈后，剧烈振摇，待分配 平衡后，弃去乙腈层即得。 5.2.20.1 %甲酸水+5 mmol/L乙酸铵水溶液：准确量取1 mL甲酸、称取0.385 g乙酸铵，用水定容至 全国团体标准信息平台 T/SDAQI038—2021 21 L，混匀。 5.2.30.5 %甲酸乙腈：准确量取5 mL甲酸，用乙腈定容至1 000 mL，混匀。 5.2.410 %乙腈水溶液：准确量取10 mL乙腈，用水定容至100 mL，混匀。 5.3标准品 氢溴酸常山酮，纯度不低于99.0 %，氢溴酸常山酮的英文名称、CAS号、分子式、相对分子质量和 结构式参见附录A。 5.4标准溶液配制 氢溴酸常山酮标准储备溶液（1.0 mg/mL）：称取适量氢溴酸常山酮标准品（精确至0.1 mg），用 甲醇溶解配制成浓度为1.0 mg/mL的标准储备液，于-18 ℃冷冻保存，有效期一年。 5.5材料 5.5.1有机相微孔滤膜（尼龙）：0.22 μm。 5.5.2塑料离心管：50 mL。 5.5.3塑料离心管：15 mL。 6仪器设备 6.1液相色谱-串联质谱仪：电喷雾离子源（ESI）。 6.2分析天平：感量0.00001g和0.01g。 6.3氮吹仪。 6.4涡旋混合器：3000r/min。 6.5离心机：转速不低于6000r/min。 6.6超声波清洗器。 7试样制备 按GB/T20195制备试样，若试样可以100 %通过1.0 mm的孔径分析筛，且混合均匀度较好，则无 需粉碎；反之粉碎过1.0 mm孔径分析筛，混匀，装入密闭容器中，2 ℃～8 ℃避光保存备用。 8试验步骤 8.1试样提取 平行做两份试验，每份试样称取2 g（精确至±0.01 g），置于50 mL具塞离心管中，加入20 mL0.5 % 的甲酸乙腈溶液（5.2.3），涡旋混合均匀，超声提取10 min，6 000 r/min离心5 min，取全部上清液至 50 mL具塞离心管中，加入15 mL乙腈饱和正己烷（5.2.1），涡旋1 min，6 000 r/min离心5 min，取10 mL 下层提取液，45 ℃下氮气浓缩至近干，用1.0 mL乙腈水溶液（5.2.4）复溶，涡旋30 s，经有机相微孔 滤膜过滤后上机测定。 8.2基质匹配标准曲线的制备 取空白饲料样品，按8.1处理制得空白基质溶液，准确量取氢溴酸常山酮标准溶液适量，用空白基 质溶液稀释，配制成氢溴酸常山酮浓度为0.5 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、 全国团体标准信息平台 T/SDAQI038—2021 3200 ng/mL的基质标准工作溶液，现配现用，供液相色谱-串联质谱仪测定。以特征离子质量色谱峰面积 为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。 8.3仪器参考条件 8.3.1液相色谱参考条件： a)色谱柱：Poroshell120EC-C18(2.1×100 mm，2.7 μm)，或性能相当者； b)流动相：A相：0.1 %甲酸+5 mmol/L乙酸铵水溶液，B相：乙腈，梯度洗脱程序见表1； c)流速：0.30 mL/min； d)柱温：35 ℃； e)进样体积：10 μL。 表1梯度洗脱表 时间，min A，% B，% 0 95 5 1 95 5 5 5 95 6 5 95 7 95 5 10 95 5 8.3.2质谱参考条件： a)离子源：电喷雾离子源； b)扫描方式：正离子扫描； c)检测方式：多反应离子监测（MRM）； d)喷雾电压：4 000 V； e)干燥气温度：350 ℃； f)干燥气流速：5 L/min； g)雾化气压力：45 psi； h)鞘气温度：250 ℃； i)定性离子对、定量离子对和碰撞能量见表2。 表2MRM参数 母离子 子离子 碎裂电压,V 碰撞能，eV 414.0 100.2* 120 20 414.0 120.0 120 20 414.0 138.0 120 25 注1：对不同质谱仪器，仪器参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化到最佳。 注2：*为定量离子。 8.4定性测定 同样测试条件下，试样溶液中氢溴酸常山酮的保留时间与标准液中的保留时间相比，偏差在±2.5 % 以内，并且在样品质谱图中，所选择的定性离子对全都检出，检测到的离子的相对离子丰度应当与浓度 相当的标准溶液的相对离子丰度一致，其允许偏差应符合表3要求。 全国团体标准信息平台 T/SDAQI038—2021 4表3定性确认时相对离子丰度的允许相对偏差 相对离子丰度，% 允许偏差，% ＞50 ±20 20～50 ±25 10～20 ±30 ≤10 ±50 8.5定量测定 按8.3.1和8.3.2设定仪器条件，以基质标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准 工作曲线，作单点或多点校准，按外标法计算试样中药物的残留量，标准工作溶液和样品中待测物的含 量均应在仪器检测的线性范围之内。标准溶液特征离子质量色谱图参见附录B。 8.6空白试验 除不加试料外，按上述测定步骤进行测定。 9试验数据处理 试样中氢溴酸常山酮的含量按式（1）计算： nmVCX …………………………………………………（1） 式中： X——试样中氢溴酸常山酮的含量，单位为微克每千克（μg/kg）； C——由标准曲线得到的试样溶液中待测物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）； V——试样提取溶液的体积，单位为毫升（mL）； n——试样的浓缩倍数； m——试样质量，单位为克（g）。 计算结果需扣除空白值。以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留3 位有效数字。 10方法灵敏度、准确度 10.1灵敏度 本方法的检测限为0.5 μg/kg，定量限为1 μg/kg。 10.2准确度 当添加水平为2 μg/kg，10 μg/kg，50 μg/kg时，回收率见附录C。 全