ICS65.120 B46T/SDAQI 团 体 标 准 T/SDAQI044—2021 饲料中产黄曲霉毒素真菌的检测 实时荧光PCR方法 DetectionofaflatoxigenicstrainsofAspergillusinanimalfeedbyReal-timePCR 2021-09-25发布 2021-10-25实施 山东质量检验协会  发布 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/SDAQI044—2021 I版权说明 本文件系由山东质量检验协会（简称“协会”）组织创制的团体标准文本（含制定过程中的草案）， 协会拥有本文件的著作权，受《中华人民共和国著作权法》保护。除法律所允许的情形或事先得到协会 书面许可外，任何组织和个人不得以任何理由进行复制、销售、传播本文件，或抄袭、歪曲本文件等侵 权行为，否则，行为人应承担相应的民事、行政责任，构成犯罪的，将依法追究其刑事责任。其他文件 引用本文件，不属侵权行为。 凡利用本文件进行或支持贸易、认证等商业活动，应事先购买正式文本或得到协会书面授权。购买 本文件或获得授权，请与协会联系。 欢迎社会各界举报侵权盗版行为，协会将依法严格保护举报人信息。 联系人：范红梅 联系电话：0531-8970198615668365153 联系邮箱：[email protected] 协会对本版权声明拥有最终解释权。 全国团体标准信息平台 T/SDAQI044—2021 II前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由山东质量检验协会提出并归口。 本文件起草单位：山东省产品质量检验研究院、滨州市食品药品检验检测中心。 本文件主要起草人：周莉莉、才美佳、王颖臻、王一村、李娜、高静静、张宇鑫、赵彤彤、侯广月、 李丽、吴树栋、于嘉伦。 本文件的所有权和解释权归山东质量检验协会。 如果您在本文件使用中发现错误或技术内容有不当之处，请及时与协会秘书处联系，将意见发送到 [email protected]。 全国团体标准信息平台 T/SDAQI044—2021 1饲料中产黄曲霉毒素真菌的检测 实时荧光PCR方法 1范围 本文件规定了植物源性饲料原料中产黄曲霉毒素的黄曲霉和寄生曲霉的实时荧光PCR检测方法。 本文件适用于植物源性饲料原料中产黄曲霉毒素的黄曲霉和寄生曲霉的检测。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB19489实验室生物安全通用要求 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB4789.15食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数 GB4789.16食品安全国家标准食品微生物学检验常见产毒霉菌的形态学鉴定 SN/T1035进出口食品中产毒青霉属、曲霉属及其毒素的检测方法 WS/T230临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用 3术语和定义、缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1实时荧光PCRreal-timePCR 在PCR反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。 3.1.2Ct值cyclethreshold 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 AlfR：产黄曲霉毒素调节基因（aflatoxinbiosynthesisregulatorygene） Omt-1：柄曲霉素转甲氧基酶基因（sterigmatocystinO-methyltransferasegene） Ver-1：杂色曲霉素A脱氢酶基因（versicolorinAdehydrogenasegene） 4原理 全国团体标准信息平台 T/SDAQI044—2021 2本文件建立的方法选用黄曲霉毒素生化合成过程中的三个关键基因（调控基因aflR、柄曲霉素转甲 氧基酶Omt-1基因和杂色曲霉素A脱氢酶Ver-1基因）的有无来判断待检菌株能否产生黄曲霉毒素。依据 黄曲霉毒素的形成机制，在以上三个关键基因都存在的前提下，才能产生黄曲霉毒素。另外使用真菌共 有的5.8SrDNA的ITS序列作为阳性参照基因用来判断提取的DNA模板和反应能否成功。 5试剂或材料 所用试剂除特殊指明外，均为分析纯。实验用水均符合GB/T6682中一级水的规定。 5.1无水乙醇。 5.2商品化萨式培养液。 5.3真菌DNA提取试剂盒。 5.42×Premix实时荧光PCR混合液。 5.5双蒸水。 6引物和探针    所需引物探针信息见表1，-20°C保存。 表1引物探针信息 目的基因 名称 序列 长度/bp产物 长度 ITS基因ITS5’引物5’-GCGCGCCTCAAATCGA-3’ 16 72 ITS3’引物5’-CGGCACCCTTTAGCGAATAG-3’ 20 ITS探针5’-(FAM)CGGCTGGGTCTTTCGTCCCCTC(BHQ1)-3’ 22 AflR基因aflR5’引物5’-CCACAATCTCATCCTCAATCGA-3’ 22 73 aflR3’引物5’-CGGAGACGCTACTGCTACCAT-3’ 21 aflR探针5’-(FAM)TCAACCACCACACGCTCTGCCC(BHQ1)-3’ 22 Omt-1基因omt-15’引物5’-CCGGTTCCTTGGCTCCTAAG-3’ 20 68 omt-13’引物5’-TGGGTGGCAGCAGCTAGAC-3’ 19 omt-1探针5’-(ROX)AACGCGTTGTCCCATCTCGATAGCG(BHQ2)-3’25 Ver-1基因ver-15’引物5’-ACTTTCACCGATGAGCAGGTAGA-3’ 23 65 ver-13’引物5’-AGGCCCACCCGGTTCA-3’ 16 ver-1探针5’-(HEX)CGCCGCTTGGCTCTCGCCT(BHQ1)-3’ 19 7仪器设备 7.1万分之一电子天平。 7.2紫外分光光度计。 7.3实时荧光PCR仪。 7.4二级生物安全柜。 7.5高压灭菌锅。 7.6高速冷冻离心机：离心力≥12000g。 7.7恒温摇床。 7.8磁力搅拌器。 7.9恒温水浴锅。 全国团体标准信息平台 T/SDAQI044—2021 37.10pH计:0.01级。 8实验步骤 8.1样品制备 按照GB4789.15执行。 8.2产黄曲霉毒素真菌的培养与初步鉴定 按照SN/T1035和GB4789.16执行。 8.3可疑产黄曲霉毒素真菌的菌丝培养 用无菌接种环挑取一环可疑产黄曲霉毒素真菌的孢子接种到装有5mL萨式培养液的试管中，在 25-28°C，180r/min摇床上培养18-24h。 8.4可疑产黄曲霉毒素真菌DNA的提取 使用真菌DNA提取试剂盒提取模板DNA。 DNA提取过程中以双蒸水代替样品设置提取空白对照，并置于每个提取系列中的最后。 推荐使用真菌DNA提取试剂盒。 8.5DNA浓度及纯度的测定 取2μLDNA模板溶液加双蒸水稀释至1mL，使用紫外分光光度计测定260nm和280nm处的吸光值 A260和A280，DNA浓度计算按式（1）计算： C=A×N×50/1000……………………………………………(1) 式中： C----DNA浓度，单位为微克每微升（μg/μL）； A----260nm处的吸光值； N----核酸稀释倍数； 当A260/A280比值在1.8～2.0之间时，DNA模板适宜荧光定量PCR扩增。 若检测DNA模板浓度不在规定范围内，可适当增加样品采样量或增加荧光定量PCR反应过程中 模板量或减少溶解DNA的溶剂的量，提高浓度，以保证检测的有效性。 8.6实时荧光PCR检测 8.6.1实时荧光PCR反应体系 表2实时荧光PCR反应体系 试剂成分 体积（单位：μL） 2×荧光定量PCR预混液 引物F（10μM） 引物R（10μM） 探针P（5μM） 样品DNA（10ng/μL～100ng/μL） ddH2O12.5 1 1 0.8 1 补至25 全国团体标准信息平台 T/SDAQI044—2021 48.6.2实时荧光PCR反应参数 95℃预变性5min，95℃变性5s，60℃退火30s，45个循环。 8.6.3实验对照 样品设置两个平行的反应体系，同时设置阳性对照、阴性对照和空白对照，阳性对照用真菌DNA 试剂盒提取的黄曲霉标准菌株的DNA作为模板，阴性对照用烟曲霉或其他合格菌株提取的DNA作为模 板，空白对照用等体积的双蒸水来代替DNA模板。计算需要进行的PCR反应个数，按上述成分比例配 置PCR反应体系，等份分装，然后再加入DNA模板。单独进行内参照基因的检测。 9质量控制 以下条件有一条不满足时，实验视为无效，需重新进行实验。 a)空白对照：无荧光对数增长，相应的Ct值＞40.0； b)阴性对照：无荧光对数增长，相应的Ct值＞40.0； c)阳性对照：有荧光对数增长且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值＜30.0； d)内参照：有荧光对数增长且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值＜30.0； 10结果判定 10.1检测结果判定 在同时符合9的情况下，使用三种基因特异性引物和探针对被检样品进行检测。如样品FAM、HEX、 ROX三种荧光