ICS 11.220 B 41 DB22 吉 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 2559—2016 牛新孢子虫病检测方法 LAMP 法 LAMP assay for detection of bovine Neosporaosis 2016 - 12 - 09 发布 吉林省质量技术监督局 2017 - 03 - 01 实施 发 布 DB22/T 2559—2016 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2015给出的规则起草。 本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。 本标准起草单位：延边大学、吉林省动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人：贾立军、柴方红、张守发、梁晚枫。 I DB22/T 2559—2016 牛新孢子虫病检测方法 LAMP 法 1 范围 本标准规定了牛新孢子虫病LAMP检测方法的技术要求。 本标准适用于牛新孢子虫病病原检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 新孢子虫病 Neosporiasis 由犬新孢子虫(Neospora caninum)引起的多种动物的一种原虫病，该病主要引起母畜的流产、死胎 或新生胎儿的运动障碍和神经系统疾病。 3.2 环介导等温扩增(LAMP) Loop-mediated isothermal amplification 针对靶基因的6个区域设计4种特异性引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件下(63℃左右) 保 温30 min～60 min，使得链置换DNA合成在不停地自我循环，即而完成的核酸扩增反应。 4 试剂 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T 6682中一级水的要求。 4.1 4.1.1 4.1.2 4.1.3 4.1.4 4.1.5 4.1.6 4.1.7 4.1.8 4.2 常规试剂 100 mg/mL 溶菌酶见附录 A.1。 10 mg/mL 蛋白酶 K 见附录 A.2。 10% 十二烷基磺酸钠见附录 A.3。 5% 十六烷基三甲基溴化铵见附录 A.4。 TE（pH8.0）见附录 A.5。 50×TAE 缓冲液见附录 A.6。 加样缓冲液见附录 A.7。 1.5%琼脂糖凝胶的制备见附录 A.8。 分子生物学试剂 1 DB22/T 2559—2016 Bst DNA Polymerase、SYBR GreenⅠ、限制性内切酶TaqⅡ、组织DNA提取试剂盒、血液DNA提取试 剂盒、溴化乙锭、DNA Marker分子量标准等。使用或稀释时均参照试剂说明书进行。 4.3 引物 表1 引物 引物序列 引物浓度 F3 ATGCTTGTGTGGTGAGGC 0.2 µmol/L B3 CAAGTGCCACCCACTGATC 0.2 µmol/L FIP CGCTGACCGATCGGTTAACTGATTGCCAAACTCAGTGCGT 1.6 µmol/L BIP TTAGCAGTTGGGGTGTCGGGTACCCTGTTTCGGGAGACA 1.6 µmol/L 4.4 标准阳性、阴性对照 4.4.1 4.4.2 5 LAMP 特异性引物序列及浓度 标准阳性样品为犬新孢子虫基因组 DNA 提取物，DNA 浓度为 10 mg～30 mg。制备方法见附录 B。 标准阴性样品健康牛组织 DNA 提取物，DNA 浓度为 10 mg～30 mg。 仪器设备 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 6 低温高速离心机（12 000 g 以上）。 恒温水浴锅（室温～100℃） 分析天平（感量 0.1 mg） 电泳槽（水平电泳槽） 电泳仪（电压 1～300 V；电流 1～400 mA） 凝胶成像系统（带紫外灯） 微量加样器（单道 2 μL、10 μL、20 μL、100 μL、200 μL、1000 μL） 其它分子生物学实验设备（振荡器、小型离心机等） 试验步骤 6.1 样品采集 无菌采集流产胎牛脑、肝、脾、肺等组织样品，或牛的血液样品，置灭菌1.5 mL塑料离心管中，进 行样品处理；或冷冻保存，备用。 6.2 样品处理 待检样品组织DNA或血液DNA的提取，按试剂盒说明书进行。 6.3 LAMP 反应 LAMP反应体系：总体系25 µL。 同时设置阳性对照、阴性对照和水对照。 LAMP反应条件：63℃反应60 min，80℃ 2 min终止反应。 2 DB22/T 2559—2016 表2 LAMP 反应体系 加样物 浓度 体积 DNA 模板 10～30 mg 2 µL MgSO4 6.0 mmol/L 3 µL dNTP 1.4 mmol/L 3.5 µL F3 0.2 µmol/L 1 µL B3 0.2 µmol/L 1 µL FIP 1.6 µmol/L 1 µL BIP 1.6 µmol/L 1 µL Bst DNA Polymerase Buffer 10× 2.5 µL Bst DNA Polymerase 8 U/µL 1 µL ddH2O 9 µL 总体系 6.4 25 µL 结果判定 6.4.1 眼观判定 × 将样品反应物加入1000 SYBR Green I 2 µL，室温放置10 min，置于凝胶成像仪的紫外灯下观察。 阳性对照样品应呈现绿色荧光，阴性对照与水对照样品应呈现棕色、无荧光。在对照成立的前提下，样 品呈现绿色荧光判为阳性，呈现棕色、无荧光判为阴性。具体参考标准见附录C.1。 6.4.2 电泳判定 取样品反应物2 µL加入到1.5%琼脂凝胶板的样品孔中，并设置标准阳性、阴性和标准分子量DNA Marker。将凝胶在150 V恒定电压下电泳30 min后，置于凝胶成像仪观察。阳性样品应呈现特征性梯状 条带，阴性与水对照样品无条带。具体参考标准见附录C.2。 3 DB22/T 2559—2016 AA 附 录 A （规范性附录） 环介导等温扩增（LAMP）常用溶液配制 A.1 100 mg/mL溶菌酶 表A.1 100 mg/mL 溶菌酶 溶菌酶 100 mg 灭菌双蒸水 A.2 定容至 1 mL 10 mg/mL蛋白酶K 表A.2 10 mg/mL 蛋白酶 K 蛋白酶 K 10 mg 灭菌双蒸水 A.3 定容至 1 mL 10% 十二烷基磺酸钠（SDS） 表A.3 10% 十二烷基磺酸钠（SDS） 十二烷基磺酸钠（SDS） 10 g 灭菌双蒸水 定容至 100 mL 注：分装，灭菌，室温保存。 A.4 5% 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB） 表A.4 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB） 灭菌双蒸水 A.5 5% 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB） 0.5 g 定容至 10 mL TE（pH 8.0） 10 mmol/L的Tris-HCl(pH 8.0)与1 mmol/L的EDTA（pH 8.0）等体积混合，高压灭菌。 A.6 4 50×TAE缓冲液 DB22/T 2559—2016 A.6.1 0.5 mol/L乙二铵四乙酸（EDTA）（pH 8.0） 表A.5 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸（EDTA）（pH 8.0） 乙二铵四乙酸二钠 18.6 g 灭菌双蒸水 80 mL 注：用氢氧化钠溶液调pH至8.0，灭菌双蒸水定容至100 mL。 A.6.2 TAE缓冲液（50×）配制 表A.6 TAE 缓冲液（50×）配制 三羟甲基氨基甲烷（Tris） 24.2 g 冰乙酸 5.71 mL 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸（EDTA）（pH 8.0） 10 mL 注：加去离子水定容至 100 mL，室温保存备用，使用时稀释 50×为工作液。 A.7 加样缓冲液 表A.7 加样缓冲液 溴酚蓝 10 mg 甘油 2.5 mL 0.5 mol/L pH 6.8 三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液 A.8 定容至 10 mL 1.5%琼脂糖凝胶的制备 表A.8 琼脂糖 1×TAE 缓冲液 1.5%琼脂糖凝胶的制备 1.5 g 定容至 100 mL 将三角瓶放在沸水浴或微波炉中加热至琼脂糖充分溶解（注意用微波炉加热时不要沸出），置室温 冷却到50 ℃左右，加入10 mg/mL的溴化乙锭10 μL，摇匀，倒入电泳板上，凝固后取下梳子，4 ℃备用。 5 DB22/T 2559—2016 BB 附 录 B （规范性附录） 标准阳性对照模板 DNA 制备 B.1 取体外培养收集的犬新孢子虫悬液 150 µL加入 1.5 mL离心管中，加入溶菌酶（100 mg/mL）15µL， 充分混匀，37℃下 1 h。 B.2 依次加入蛋白酶K(10 mg/ml) 9 µL、10% SDS 105 µL、5 mol/L NaCl 150 µL、5% CTAB 240 µL， 充分混匀后，65℃下 10 min。 B.3 加入等体积Tris-饱和酚和氯仿反复抽提两次，氯仿洗涤一次。 B.4 取上层于另一 1.5 mL离心管中，加入等体积无水乙醇和 1/10 体积醋酸钠沉淀 30 min。 B.5 4℃下 12 000 r/min离心 15 min，弃上清。 B.6 将 70%乙醇 100 µL沿管壁徐徐加入，4℃下 12 000 r/min离心 1 min，吸弃上清，干燥。 B.7 用 20 µL TE溶解DNA，取一部分测定OD260 和OD280，计算所提的DNA浓度和纯度，其余基因组总 DNA于 -20℃保存、备用。 6 DB22/T 2559—2016 CC 附 录 C （规范性附录） LAMP 扩增结果判定标准 C.1 眼观判定LAMP扩增标准： 1 2 图C.1 LAMP 扩增后加入 SYBR Green I 紫外灯下眼观结果 注1：标准阳性对照 注2：标准阴性对照 C.2 电泳判定LAMP扩增标准： 图C.2 LAMP 扩增电泳结果 M:DL 2000 DNA Marker； 注1：标准阳性对照 注2：标准阴性对照 _________________________________ 1