ICS 67.060 X 04 DB22 吉 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 2520—2016 养殖鱼中喹诺酮类药物残留量的测定 高效液相色谱-串联质谱法 Determination of quinolones residues in cultured fish HPLC-MS/MS method 2016 - 12 - 09 发布 吉林省质量技术监督局 2017 - 03 - 01 实施 发 布 DB22/T 2520—2016 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009 和GB/T 20001.4-2015 给出的规则起草。 本标准由珲春出入境检验检疫局提出。 本标准由吉林省水利厅归口。 本标准起草单位：珲春出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：牛悦齐、张琦、翟亚楠、姜佳颖、李晶、贾佳、张盼盼、王雪、董晓宁。 I DB22/T 2520—2016 养殖鱼中喹诺酮类药物残留量的测定 高效液相色谱-串联质谱法 1 范围 本标准规定了草鱼、鲢鱼、鳙鱼、鲶鱼中吡哌酸、依诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、沙 拉沙星、西诺沙星 7 种喹诺酮类药物残留量的高效液相色谱-串联质谱测定方法。 本标准适用于草鱼、鲢鱼、鳙鱼、鲶鱼中吡哌酸、依诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、沙 拉沙星、西诺沙星 7 种喹诺酮类药物残留量的定量和确证。 2 原理 用0.1% 冰乙酸-乙腈提取样品中的喹诺酮类药物残留，将离心后的加有PSA、C18吸附剂粉末的溶液 净化，过0.22 μm 有机滤膜后，用高效液相色谱-串联质谱法测定，外标法定量。 3 试剂或材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的二级水。 3.1 无水乙酸钠。 3.2 无水硫酸镁。 3.3 甲醇（CH3OH）：色谱纯。 3.4 乙腈（CH3CN）：色谱纯。 3.5 正己烷（C6H14）：色谱纯。 3.6 甲酸（CH2O2）。 3.7 冰乙酸（C2H4O2）。 3.8 0.1%冰乙酸乙腈溶液：取 1.0 mL 冰乙酸（3.7）于 1000 mL 乙腈（3.4）中，混匀。 3.9 1%甲酸溶液：取 1.0 mL 甲酸（3.6）定容至 100 mL 容量瓶中。 3.10 样品定容液（V/V，87/13）：1%甲酸（3.9）+乙腈（3.4）。 3.11 吡哌酸（分子式：C14H17N5O3,CAS 号:51940-44-4）、依诺沙星（分子式：C15H17FN4O3，CAS 号:74011-58-8）、诺氟沙星（分子式：C16H18FN3O3 ,CAS 号:70458-96-7）、环丙沙星（分子式：C17H18FN3O3,CAS 号:85721-33-1）、恩诺沙星（分子式：C19H22FN3O3,CAS 号:93106-60-6）、沙拉沙星（分子式：C20H17F2N3O3,CAS 号:98105-99-8）、西诺沙星（分子式：C12H10N2O5,CAS 号:28657-80-9）标准品：含量≥98.0%。 3.12 标准储备溶液（100.0 μg/mL）：分别准确称取 7 种喹诺酮类标准品 10 mg（精确到 0.01 mg）， 用甲醇溶解并定容于 100 mL 棕色容量瓶中，配制成浓度为 100 µg/mL 的标准储备液。0-4℃冷藏避光保 存，使用前放置至室温。 3.13 中间混合标准储备液（1.0 μg/mL）：准确移取 1.0 mL 标准储备溶液（3.12），用基质液定容 于 100 mL 棕色容量瓶中。现用现配。 3.14 基质混合标准工作液（100.0 ng/mL）：准确移取 1.0 mL 标准储备溶液 3.13），用基质液定容 于 10 mL 棕色容量瓶中。现用现配。 1 DB22/T 2520—2016 3.15 有机相微孔滤膜：0.22 μm。 4 仪器设备 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 液相色谱-质谱/质谱仪：配备电喷雾离子源（ESI）。 均质器：转速不低于 8 000 r/min。 组织捣碎机。 氮吹仪。 分析天平：感量±0.1 mg。 超声波清洗机。 涡旋混合器。 旋转蒸发仪。 5 样品 5.1 制备 至少取3尾鱼清洗后，去头、骨、内脏，取肌肉等可食部分，样品取样量400 g，分为两份，其中一 份用于检验，另一份做为留样，将试样用组织捣碎机粉碎后混匀。 5.2 样品的保存 在-18 ℃温度以下保存，测定时取出混匀后使用。 6 试验步骤 6.1 提取 称取5.0 g试样（精确至0.01 g）于150 mL具塞锥形瓶中，加入50 mL含0.1%冰乙酸的乙腈溶液（4.8）， 分别加入1.0 g无水乙酸钠（4.1）和2.0 g无水硫酸镁（4.2），涡旋振荡1min，8 000 g/min 均质2 min。 提取液过滤于250 mL浓缩瓶中，残渣分别用2×10 mL乙腈洗涤2次，合并提取液，在40 ℃以下浓缩至近 干。 6.2 净化 在上述浓缩瓶中加入1.0 mL样品定容液,100 mg以上的PSA吸附剂和100 mg以上的C18吸附剂 ,涡旋振 荡1 min后静止，取上清液过滤膜（有机系滤膜），供高效液相色谱-串联质谱仪测定。 6.3 空白试验 除不添加试样外，其余按上述步骤6.1～6.2做空白测定。 7 测定 7.1 液相色谱条件 液相色谱条件如下： 2 DB22/T 2520—2016 a) b) c) d) e) f) 7.2 色谱柱： C18 色谱柱， 150 mm×2.1 mm 内径，膜厚 3.5 μm 或相当者； 流动相 A：0.1%甲酸； 流动相 B：乙腈； 流速：0.4 mL/min； 进样量：10 μL。 梯度洗脱，洗脱程序见附录 A 中 A.1。 质谱参考条件 质谱参考条件如下： a) 电离方式：电喷雾电离（ESI）； b) 扫描方式：正离子扫描，多反应监测（MRM）； c) 离子源温度：600℃； d) 雾化气、气帘气、辅助加热器、碰撞气均为高纯氮气； e) 喷雾电压、去簇电压、碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度； f) 母离子、子离子、去簇电压、碰撞能量见附录 A 中 A.2。 7.3 标准工作曲线 将浓度为 2.0 ng/mL、4.0 ng/mL、10.0 ng/mL 、20.0 ng/mL、50.0 ng/mL、100.0 ng/mL的标准 工作溶液，按参考色谱和质谱条件测定。以7种喹诺酮类药物的质量浓度为横坐标，相应的峰面积响应 值为纵坐标，进行线性回归分析。 7.4 定性分析 在同一色谱/质谱条件下进行标准溶液和样品溶液的测定，如果样品溶液中检出的色谱峰的保留时 间与标准物质色谱峰的保留时间一致（7种喹诺酮类药物液相色谱 质谱/质谱图见附录B 中B.1），所选 择的两对子离子的质荷比也一致，而且样品定性离子的相对丰度与浓度相当标准工作溶液的定性离子的 相对丰度相比较，相对标准偏差不超过表1规定的范围，则可判定样品中存在该物质。 表1 定性确定时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 ＞50% ＞20%至50% ＞10%至20% ≤10% 允许的相对偏差 ±20% ±25% ±30% ±50% 7.5 定量测定 根据试样中被测样液中被测组分的含量情况，选取响应值相近的标准工作液和样液进行穿插进行分 析，对于高浓度样品须适当进行系列稀释。标准工作液和样液中被测组分的响应值均应在仪器线性范围 内，外标法定量。 8 试验数据处理 用色谱数据处理机或按公式（1）计算试样中喹诺酮类药物残留含量，计算结果需扣除空白值。 X = c i × V ……………………….………………… (1) m 3 DB22/T 2520—2016 式中： X ——试样中被测组分残留量，单位为微克每千克 （μg/kg）； ci——从标准曲线读出的被测组分溶液浓度，单位为微克每毫升（ng/mL）； V——样液最终定容体积，单位为毫升 （mL）； m——样液所代表的最终试样的质量，单位为克 （g）； 注：计算结果保留三位有效数字。 9 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于这两个测定结果的算术平均值的10%。 10 其他 在称样5.0 g的情况下，本方法吡哌酸、依诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、 西诺沙星定量限为 2.0 μg/kg。 4 DB22/T 2520—2016 AA 附 录 A （资料性附录） 洗脱程序 A.1 液相色谱梯度洗脱条件见表A.1 表A.1 液相色谱梯度洗脱条件 A.2 时间 0.1%甲酸 乙腈 min % % 0.00 87 13 2.00 87 13 7.00 10 90 8.00 10 90 9.00 87 13 11.00 87 13 7 种喹诺酮类药物的质谱参数见表A.2 表 A.2 化合物名称 7 种喹诺酮类药物的质谱参数 母离子 子离子 去簇电压 碰撞能量 m/z m/z V EV 286.2* 40 38 189.2 40 47 303.2* 50 23 234.2 50 24 276.2 * 51 25 233.2 51 28 314.2* 37 30 231.1 37 32 316.3* 47 20 245.2 47 39 299.2* 47 40 342.2 47 25 245.1* 50 11 189.1 50 31 吡哌酸 304.1 依诺沙星 321.1 诺氟沙星 320.2 盐酸环丙沙星 332.2 恩诺沙星 360.2 沙拉沙星 386.2 西诺沙星 263.1 注：加“*”的为定量离子。 5 DB22/T 2520—2016 BB 附 录 B （资料性附录） 液相色谱-质谱/质谱图 液相色谱-质谱/质谱图见图B.1 图B.1 7 种喹诺酮类药物 HPLC-MS/MS 1-吡哌酸 2-依诺沙星 3-诺氟沙星 6-沙拉沙星 7-西诺沙星 4-盐酸环丙沙星 _________________________________ 6 5-恩诺沙星