(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210614221.2 (22)申请日 2022.05.31 (71)申请人 江苏省农业科 学院 地址 210014 江苏省南京市钟灵街5 0号 (72)发明人 张晶　黄红英　曹云　王秋君　 孙倩　 (74)专利代理 机构 南京苏高专利商标事务所 (普通合伙) 32204 专利代理师 孙斌 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C05F 15/00(2006.01) C05F 17/20(2020.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 产高温蛋白酶、 高温淀粉酶和高温脂肪酶的 复合菌剂及其制备方法和应用 (57)摘要 本发明公开了一种 产高温蛋白酶、 高温淀粉 酶和高温脂肪酶的复合菌剂及其制备方法和应 用， 所述复合菌剂包括副土芽孢杆菌、 嗜热脂肪 地芽孢杆菌和嗜热栖热菌。 将副土芽孢杆菌、 嗜 热脂肪地芽孢杆菌和嗜热栖热菌分别进行液体 发酵， 将培养好的发酵液混合即得液体复合微生 物菌剂； 将液体复合微生物菌剂均匀撒到稻壳 粉、 秸秆粉和凹凸棒土组成的辅料上， 干燥后获 得固体微生物菌剂。 该复合菌剂能够在超 过65℃ 的高温条件 下降解有机废弃物中的蛋白质、 淀粉 和脂肪等物质， 可 以有效应用在在高温堆肥中， 提高堆体最高温度， 延长堆肥高温期天数， 使得 堆肥产物的种子发芽指数显著提高。 权利要求书1页 说明书6页 附图1页 CN 115044503 A 2022.09.13 CN 115044503 A 1.一种产高温蛋白酶、 高温淀粉酶和高温脂肪酶的复合菌剂， 其特征在于， 所述复合菌 剂包括副土芽孢杆菌(Parageobacillus  sp.)、 嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus   stearothermophi lus)和嗜热栖热菌(Thermus  thermophi lus)。 2.根据权利要求1所述的产高温蛋白酶、 高温淀粉酶和高温脂肪酶的复合菌剂， 其特征 在于， 所述副土芽孢杆菌为Parageobacillus  sp.NY44， 所述嗜热脂肪地芽孢杆菌为 Geobacillus  stearothermophilus  CCTCC AB 2013010； 所述嗜热栖热菌为Thermus   thermophi lus CGMCC 1.15099。 3.根据权利要求1所述的产高温蛋白酶、 高温淀粉酶和高温脂肪酶的复合菌剂， 其特征 在于， 所述所述副土芽孢杆菌、 嗜热脂肪地芽孢杆菌和嗜热栖热菌活菌数之比为0.5 ‑1:1‑ 5:1‑2。 4.一种权利要求1所述的产高温蛋白酶、 高温淀粉酶和高温脂肪酶的复合菌剂的制备 方法， 其特征在于， 将副土芽孢杆菌、 嗜热脂肪地芽孢杆菌和嗜热栖热菌分别进行液体发 酵； 将培养好的发酵液混合即得液体复合微生物菌剂； 将液体复合微生物菌剂均匀 撒到稻 壳粉、 秸秆粉和凹凸棒土组成的辅料 上， 干燥后获得固体微 生物菌剂。 5.根据权利要求 4所述的制备 方法， 其特 征在于， 所述制备 方法为： (1)菌种活化： 三种菌株分别接种于固体培养基， 培养， 挑取单菌落接种到液体培养基， 培养得到接种液； (2)一级种子液制备： 按照 体积比5％‑10％的接种量向液体培养基中接入步骤(1)制备 的接种液， 培 养得到一级种子液； (3)发酵液制备： 按照 体积比2％ ‑5％的接种量向装有发酵培养基的发酵罐中接入步骤 (2)制备的一级种子液， 培 养即得各菌株发酵 液； (4)菌剂制备： 将步骤(3)制备的各菌发酵液混合即得复合微生物菌剂； 将混合后发酵 液均匀撒到稻壳粉、 秸秆粉和凹凸棒土组成的辅料 上， 干燥后获得固体复合 微生物菌剂。 6.根据权利 要求5所述的制备方法， 其特征在于， 所述 固体培养基： 蛋白胨10 ‑15g， 氯化 钠10‑15g， 酵母粉5 ‑10g， 琼脂20g， 加水定容至1L； 所述液体培养基为： 蛋白胨10 ‑15g， 氯化 钠10‑15g， 酵母粉5 ‑10g， 加水定容至1L； 所述发酵培养基： 红糖15 ‑20g， 硫酸铵1.0 ‑2.0g， 蛋 白胨2‑3g， 酵母粉1‑2g， 氯化钠5 ‑10g， 加水定容至1L。 7.根据权利要求5所述的制 备方法， 其特征在于， 步骤(1)中培养至OD600值达0.6 ‑0.8 即得接种液； 步骤(2)中培 养至OD600值达0.8‑1.0， 即为 一级种子液。 8.根据权利 要求5所述的制备方法， 其特征在于， 步骤(3)中接入步骤(2)制备的一级种 子液， 优选通气量为6m3/h， 搅拌速度为180 ‑220rpm， 65 ‑70℃培养至发酵罐中活菌数大于1 ×108cfu/mL时即得 各菌株发酵 液。 9.一种产高温蛋白酶、 高温淀粉酶和高温脂肪酶的复合菌剂在高温堆肥中的应用。 10.根据权利要求9所述的应用， 其特征在于， 所述应用为： 将猪粪和秸秆混合， 将液体 复合微生物菌剂与物料混合， 充分 混匀后开始堆制。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115044503 A 2产高温蛋白酶、 高 温淀粉酶和高 温脂肪酶的 复合菌剂及其制 备方法和应用 技术领域 [0001]本发明属于生物技术领域， 具体涉及一种产 高温蛋白酶、 高温淀粉酶和高温脂肪 酶的复合菌剂及其制备 方法和应用。 背景技术 [0002]堆肥化是实现有机固体废弃物无害化、 减量化处理和 资源化利用的重要途径。 高 温对于堆肥进程具有重要意义， 只有在高温阶段， 堆体内病原菌才能被灭活， 从而达到无害 化目的； 高温阶段也是堆肥有机质快速降解关键时期， 是影响堆肥腐熟周期的重要因素； 而 另一方面， 堆肥过程的重要驱动者 ‑ “微生物”对温度敏感， 随着温度的升高， 微生物活性将 受到很大的抑制， 最终会限制有机物质的快速降解和影响堆肥腐熟周期。 [0003]通过接种菌剂的方法可提高堆肥效率， 缩短堆肥周期。 然而， 并不是所有的菌剂都 能在堆肥过程中充分发挥作用。 究其原因， 主要是接种的功能微生物多数为常温菌和中温 菌， 在堆肥高温期生长会受到抑制， 导致其对堆肥环境中的蛋白质、 淀粉、 脂肪等有机物分 解利用不充分， 从而达不到预期效果。 极端 嗜热菌是一类最适生长温度在60～80℃的高温 微生物， 与常温菌和中温菌相比， 其更能适应堆肥高温环境， 可以在堆肥高温期快速降解有 机物， 从而缩短堆肥发酵时间。 因此， 筛选嗜高温且能利用堆肥有机物增殖的极端嗜热菌并 复配成复合菌剂对于加快有机废弃物的堆肥化进程， 提高堆肥产品 品质意义重大。 发明内容 [0004]发明目的： 针对现有技术存在的问题， 本发明提供一种产高温蛋白酶、 高温淀粉 酶 和高温脂肪酶的复合菌剂， 该复合菌剂能够在 超过65℃的高温条件 下降解有机废弃物中的 蛋白质、 淀粉和脂肪等物质， 可以有效应用在 在高温堆肥中。 [0005]本发明还提供 所述复合 微生物菌剂的制备 方法以及 在高温堆肥中的应用。 [0006]技术方案： 为了实现上述目的， 本发明所述一种产高温蛋白酶、 高温淀粉 酶和高温 脂肪酶的复合菌剂， 所述复合菌剂包括副土芽孢杆菌(Parageobacillus  sp.)、 嗜热脂肪地 芽孢杆菌(Geobaci llus stearothermophi lus)和嗜热栖热菌(Thermus  thermophi lus)。 [0007]作为优选， 所述副土芽孢杆菌为Parageobacillus  sp.NY44， 所述嗜热脂肪地芽孢 杆菌为Geobacillus  stearoth ermophilus  CCTCC AB 2013010； 所述嗜热栖热菌为Thermus   thermophi lus CGMCC 1.15099。 [0008]作为优选， 所述所述副土芽孢杆菌、 嗜热脂肪地芽孢杆菌和嗜热栖热菌活菌数之 比为0.5‑1:1‑5:1‑2。 [0009]本发明所述的产 高温蛋白酶、 高温淀粉酶和高温脂肪酶的复合菌剂的制 备方法， 将副土芽孢杆菌、 嗜热脂肪地芽孢杆菌和嗜热栖热菌分别进行液体发酵； 将培养好的发酵 液混合即得液体复合微生物菌剂； 将液体复合微生物菌剂均匀 撒到稻壳粉、 秸秆粉和凹凸 棒土组成的辅料 上， 干燥后获得固体微 生物菌剂。说　明　书 1/6 页 3 CN 115044503 A 3