(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210658091.2 (22)申请日 2022.06.10 (83)生物保 藏信息 CGMCC NO.20623 2020.09.09 (71)申请人 上海市农业科 学院 地址 201106 上海市闵行区北翟路2 901号 (72)发明人 王金斌　周益帆　岳童　黄艳娜　 何川　蒋玮　吕贝贝　刘华　 曾海娟　叶海龙　白寅霜　 (74)专利代理 机构 上海开祺知识产权代理有限 公司 31114 专利代理师 费开逵 (51)Int.Cl. C12N 1/02(2006.01) C12N 1/04(2006.01)C12N 13/00(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) C12P 17/10(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种高通量分离植物根际微生物并培养筛 选产IAA菌株的方法 (57)摘要 一种高通量分离植物根际微生物并培养筛 选产IAA菌株的方法， 本方法从新鲜植物根际中 利用低、 中和高三种频率超声波共同处理， 增加 植物根际微生物从根上释放出来的种类及数量， 增加了根际微生物的获得。 随后利用96孔板高通 量分离培养细菌， 使用梯度稀释的方法增加获得 单一细菌的比例。 本发明采用 双向同步进行IAA 显色反应和菌种保存， 高通量筛选产IAA根际原 位菌株， 为根际微生物的功能及与植物的互作研 究提供更好的菌种资源。 使获得单菌株的获得率 提升至100％， 不需要常规平板划线纯化菌株， 大 大提高筛 选效率。 权利要求书1页 说明书7页 附图2页 CN 115011482 A 2022.09.06 CN 115011482 A 1.一种高通量分离植物根际微生物并培养筛选产IAA菌株的方法， 其特征在于， 包括以 下步骤： 1)获得根际土壤样本微 生物菌悬 液 将采集到的健康生长的农作物根际样品室温下用活性保持型缓冲液超声处理10～ 40s， 得到含有丰富微生物的根际微生物样品悬浮液， 随后 将根际微生物样品悬浮液过滤收 集过滤液， 获得根际土悬浮液， 得到的根际土悬浮液在2 ～7℃保存备用； 超声条件为同时采用三种不同频率的超声波进行处理， 所述超声波频率分别为15～ 30KHz、 45～60KHz、 80～10 0KHz； 所述活性保持型缓冲液包含5～9.5mM  Na2HPO4， 110～140mM NaCl， 1～3mM  KH2PO4， 1～ 3.5mMKCl， 3～7％小微球藻多糖， pH为6.5 ‑7.5； 2)确定分离 培养最适稀释浓度 将根际土悬浮液加入高通量分离液体培养基中， 梯度稀释根际土悬浮液， 获得浓度不 同的根际土稀释液， 在无菌操作下将不同浓度的根际土稀释液分别移入不同的96孔细胞培 养板孔内培养， 另取未添加根际土悬浮液的5～15％TSB溶液为阴性对照， 每个样 品设三个 以上重复， 将96孔细胞培 养板封口放置 于摇床上， 28～37℃， 80～180r/mi n培养2～10天； 96孔细胞培养板内有20～35 ％的孔内呈现肉眼可见浑浊状态， 该96孔细胞培养板对应 的根际土稀释液浓度作为分离 培养的最适稀释浓度； 所述高通量分离液体培养基含有： 50～150mg/L的L ‑色氨酸， 10～30g/L酪蛋白多肽， 10 ～30g/L大豆蛋白多肽， 2 ‑7g/L氯化钠， PH为6.0 ‑8.0； 3)筛选产IAA单一菌株； 在无菌操作 下将最适稀释浓度的根际土稀释液移入细胞培养板孔内， 将细胞培养板封 口放置在摇床上， 28～37℃， 80～180r/min培养培养2～10天； 培养完成吸取细胞培养板孔 内的浑浊菌液于白色陶瓷板， 加入Salkowski显色液进行显色反应， 同时以IAA标准液作为 阳性对照； 含有50 ‑150mg/L的L ‑色氨酸， 10 ‑30g/L酪蛋白多肽， 10 ‑30g/L大豆蛋白多肽， 2 ‑ 7g/L氯化钠， PH为6.0 ‑8.0的液体培养基溶液为阴性对照； 白色陶瓷板置于室温， 避光条件 下放20～40min后观察， 颜色变红者表示能够产生IAA； 根据IAA显色反应的结果对产IAA的 细胞培养板中的菌株进行编号保藏。 2.根据权利要求1所述的高通量分离植物根际微生物并培养筛选产IAA菌株的方法， 其 特征在于， 步骤1)中， 超声处 理时间为20～40s。 3.如权利要求1所述的高通量分离植物根际微生物并培养筛选产IAA菌株的方法， 其特 征在于， 步骤3)中， 所述 IAA标准液中， IA A的浓度为10～10 0mg/L。 4.如权利要求1所述的高通量分离植物根际微生物并培养筛选产IAA菌株的方法， 其特 征在于， 所述农作物为青菜、 番 茄、 生菜或菠菜。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115011482 A 2一种高通量分离植物 根际微生物并培养筛选产IA A菌株的 方法 技术领域 [0001]本发明属于环境微生物学技术领域， 具体涉及一种高通量分离植物根际微生物并 培养筛选产IAA菌株的方法。 背景技术 [0002]根系是农作物 吸收营养和水分的主要器官， 也是植物和微生物互作的主要场所。 自然生长的农作物， 其根系表面从土壤中富集了大量且种类繁多的微生物， 统称为根际微 生物组。 [0003]根际微生物包括有益、 有害和中性微生物， 在植物的生长过程中扮演着重要角色。 目前， 植物根际微生物组的研究主要以描述性工作为主， 主要是利用高通量扩增子和宏基 因组测序技 术， 描述自然土壤中生长的各种植物根际微 生物组的物种分类和基因 组成。 [0004]植物根际微生物组的研究正在进入快速发展期， 下一阶段必然着重研究根际微生 物组在植物中的功能， 并逐渐揭示 植物与根际微 生物组互作过程的分子 机制。 [0005]目前， 阻碍根际微生物功能及植物与微生物互作研究的关键因素是根际微生物 资 源。 尽管国际储备中心已经存储了成千上万的微生物， 但这些微生物来自于多种环境和物 种。 微生物在特定生态位的定殖能力很可能在不同栖息地和不同物种根部产生分化， 因此 有必要从给定的土壤和宿 主中分离培养原位的微生物， 为根际微生物的功能及与植物的互 作研究提供 更好的菌种资源。 [0006]中国专利201811048405.7公开了 “巨菌草根际促生菌及其应用 ”， 中国专利 202111203354.2公开了 “一种植物 根际促生菌及其应用 ”， 以上专利中公开的微生物菌株筛 选的方法， 都是通过平板稀释法对植物根际促生菌进行分离筛选。 现有的平板稀释法需要 进行多次培养， 且需要划线 纯化菌株从而获得单一纯菌株。 获得的菌株再进行功能验证， 整 个筛选过程周期长且操作繁琐。 [0007]中国专利202122887945.8公开了 “一种Salkowski法定性筛选分泌IAA  菌株的装 置”， 该实用新型专利要求书主要是反应板和遮光罩装置， 实现多样本同时实验并能有效起 到遮光作用， 防止光的存在影响Sal kowski法检测过程中的显色反应。 [0008]综上所述， 目前主要通过平板稀释法对根际微生物进行分离筛选， 这需要进行多 次培养， 且需要划线 纯化菌株从而获得单一纯菌株， 获得的菌株再进 行功能验证， 整个筛选 过程周期长且操作繁琐。 [0009]原位分离培养微生物对于揭示微生物在植物生长和健康中的功能非常重要。 分离 培养的微生物和无菌体系相结合， 推动根际微 生物组从描述向功能研究发展的重要技 术。 发明内容 [0010]本发明提供一种高通量分离植物根际微生物并培养筛选产IAA菌株 的方法， 高通 量筛选产IAA的根际原 位菌株， 使获得单菌株的获得率提升至100％， 大大提高筛选效率， 为说　明　书 1/7 页 3 CN 115011482 A 3