(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210650461.8 (22)申请日 2022.06.10 (71)申请人 南宁邦尔克生物技 术有限责任公司 地址 530000 广西壮 族自治区南宁市高新 大道62号1#厂房 (72)发明人 李晓明　卢运琨　梁树华　韦航　 李丛　陆迪　于春娇　 (74)专利代理 机构 北京达友众邦知识产权代理 事务所(普通 合伙) 11904 专利代理师 胡成忠 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12P 19/30(2006.01) C12R 1/125(2006.01) (54)发明名称 一种高效生产烟酰胺单核苷酸的枯草芽胞 杆菌培养基 (57)摘要 本发明涉及生物 技术领域， 且公开了一种高 效生产烟酰胺单核苷酸的枯草芽胞杆菌培养基， 其包括如下组分： 碳源20 ‑50g/L， 酵母浸膏5 ‑ 20g/L， 钠盐0.2 ‑2g/L， 钾盐 1‑10g/L。 该高效生产 烟酰胺单核苷 酸的枯草芽胞杆菌培养基， 提供组 分优化的发酵培养基， 以用于利用重组枯草芽孢 杆菌高效发酵生产烟酰胺单核苷 酸， 通常培养基 优化的目的是利用高密度培养以获得更多的菌 体， 从而得到 更高的表达产物， 然而， 这个办法对 于利用重组枯草芽孢杆菌发酵转化烟酰胺得到 烟酰胺单核苷酸并不适用， 因此， 本发明调整发 酵培养的成分， 减少或剔除不利于烟酰胺单核苷 酸生成的组分， 提高或优化有利于烟酰胺单核苷 酸生成的组分， 从而获得一种高效生产烟酰胺单 核苷酸的枯 草芽胞杆菌培养基。 权利要求书1页 说明书3页 CN 114921381 A 2022.08.19 CN 114921381 A 1.一种高效生产烟酰胺单核苷酸的枯草芽胞杆菌培养基， 其特征在于， 其包括如下组 分： 碳源20‑50g/L， 酵母浸膏5 ‑20g/L， 钠盐0.2 ‑2g/L， 钾盐1 ‑10g/L， 镁盐2 ‑20g/L， 磷酸盐 5‑20g/L， 铵盐1 ‑5g/L。 2.根据权利要求1所述的枯草芽胞杆菌培养基， 其特征在于， 所述碳源包括葡萄糖， 甘 油， 山梨糖醇中的一种或者至少两种的组合， 优选为甘油； 所述的钠盐优选为柠檬酸钠； 所述的钾盐和磷酸盐优选为磷酸氢二钾 和/或磷酸 二氢钾； 所述的镁盐优选为硫酸镁； 所述的铵盐优选为硫酸铵。 3.根据权利要求2所述的枯 草芽胞杆菌培养基， 其特 征在于， 所述 其由以下组分组成： 甘油30‑40g/L， 酵母浸膏15 ‑20g/L， 磷酸氢二钾6 ‑8g/L， 磷酸二氢钾1 ‑3g/L， 柠檬酸钠 1‑2g/L， 硫酸镁5 ‑10g/L， 硫酸铵1 ‑3g/L。 4.一种烟酰胺单核苷酸的制备 方法， 其特 征在于， 工艺 步骤如下： S1:一级种的制备： 从含新霉素20ug/ml的LB平板上挑选含烟酰胺磷酸核糖转移 酶表达 元件的重组枯草芽孢杆菌株单菌落， 接入4ml  LB液体培养基中， 于37℃、 220rpm培养过夜， 所得的菌种为 一级种； S2； 二级种的制备： 将一级种接种于800ml  LB液体培养基， 于37℃， 220rpm培养至OD600 为0.6左右， 时间为 4～5小时； S3:三级种的制备： 将二级种接种到80L权利 要求书1‑3所述的发酵培养基中， 在37℃条 件下， 以柠檬酸、 NaOH控pH  7.0左右， 通风搅拌， 溶氧控制在20～ 30％， 培养至OD600为0.6左 右， 时间为5～6小时； S4:生产罐发酵： 将三级种接种到3T权利要求书1 ‑3所述的发酵培养基中中， 加入 0.1％‑1％烟酰胺， 在36～38℃条件下， 通风搅拌， 溶氧控制在20～30％， 以柠檬酸、 NaOH控 pH 6～8,培养24‑48小时,破胞后分离纯化可 得烟酰胺单核苷酸产品。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114921381 A 2一种高效生产烟酰胺单核 苷酸的枯草芽胞杆菌培养基 技术领域 [0001]本发明涉及 生物技术领域， 具体为一种高效生产烟酰胺单核苷酸的枯草芽胞杆菌 培养基。 背景技术 [0002]烟酰胺单核苷酸(NMN)作为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+， 也称辅酶I)的前体物 质， 在抗衰 老的应用中表现出非常好的前景。 目前， 烟酰胺单核苷 酸多使用微生物发酵法和 体外酶法转化来进行生产。 体外酶法转化需要收集纯化所需的酶制剂， 且需要使用酶转化 反应的各种底物， 底物成本较高； 微生物发酵法只需使用烟酰胺作为反应底物， 成本低， 但 目前所报道的大肠杆菌发酵法和和酵母发酵法获得的产品得率较低， 只有不到16mg/L 发酵 液， 达不到商业化生产要求。 枯草芽孢杆菌(Bacillus  subtilis)有长期制备发酵食品的历 史， 是非致病的， 不产内毒素和致热致敏蛋白质， 是一种食品级的安全微生物， 已被广泛应 用于酶制剂等 生物制品的生产。 [0003]通过酶基因克隆及改造、 代谢通路优化等手段改造枯草芽孢杆菌作为细胞工厂， 得到能够高效转化生产烟酰胺单核苷酸的枯草芽孢杆菌菌株。 研究中发现， 培养基的组分 及培养条件对烟酰胺单核苷酸的产量影响非常大.传统的高密度 表达虽然能够提高发酵液 中的菌体含量， 但烟酰胺单核苷酸的表达量不一定理想。 本发明通过优化发酵培养基的组 分和培养条件， 提高重组枯 草芽孢杆菌发酵生产烟酰胺单核苷酸的产量。 发明内容 [0004](一)解决的技 术问题 [0005]针对现有技术的不足， 本发明提供了一种高效生产烟酰胺单核苷酸的枯草芽胞杆 菌培养基， 解决了上述背景技 术中所提出的问题。 [0006](二)技术方案 [0007]本发明提供如下技术方案： 一种高效生产烟酰胺单核苷酸的枯草芽胞杆菌培养 基， 其包括如下组分： [0008]碳源20‑50g/L， 酵母浸膏5 ‑20g/L， 钠盐0.2 ‑2g/L， 钾盐1 ‑10g/L， 镁盐2 ‑20g/L， 磷 酸盐5‑20g/L， 铵盐1 ‑5g/L。 [0009]进一步的， 所述碳源包括葡萄糖， 甘油， 山梨糖醇中的一种 或者至少两种的组合， 优选为甘油； [0010]所述的钠盐优选为柠檬酸钠； [0011]所述的钾盐和磷酸盐优选为磷酸氢二钾 和/或磷酸 二氢钾； [0012]所述的镁盐优选为硫酸镁； [0013]所述的铵盐优选为硫酸铵。 [0014]进一步的， 所述 其由以下组分组成： [0015]甘油30‑40g/L， 酵母浸膏15 ‑20g/L， 磷酸氢二钾6 ‑8g/L， 磷酸二氢钾1 ‑3g/L， 柠檬说　明　书 1/3 页 3 CN 114921381 A 3