(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210830407.1 (22)申请日 2022.07.15 (71)申请人 通辽梅花生物科技有限公司 地址 028024 内蒙古自治区通辽市科尔沁 区木里图工业园区 (72)发明人 高鹏　陈钊　吴涛　褚凡　常利斌　 龚华　李岩　 (74)专利代理 机构 内蒙古欣洋 瑞专利代理有限 公司 151 10 专利代理师 刘彩霞 (51)Int.Cl. C12P 13/08(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12R 1/15(2006.01) (54)发明名称 一种高效生产L-缬氨酸的方法 (57)摘要 本发明公开了一种高效生产L ‑缬氨酸的方 法， 其包括种子液培养阶段、 需氧发酵阶段和厌 氧发酵阶段， 最终得到发酵液。 本发明在发酵过 程前期需维持有氧环境， 到达 所需OD562数后进入 厌氧环境， 在厌氧发酵阶段通过流加葡萄糖溶液 将发酵培养基中葡萄糖含量控制在5 ‑20g/L， 并 补加含有磷酸二氢钾、 磷酸氢二钾、 硫酸镁、 钴胺 素的促进剂进行发酵， 使得L ‑缬氨酸的产量可以 达到90g/L以上， 糖酸转化率可以达到55％以上， 大大提高了生产效率。 权利要求书1页 说明书6页 CN 115197979 A 2022.10.18 CN 115197979 A 1.一种高效生产L ‑缬氨酸的方法， 其特 征在于， 其包括如下步骤： (1)种子培养得到种子液： 以谷氨酸棒状杆菌为出发菌株， 将出发菌株接种至种子培养 基中培养得到种子液， 控制种子液OD562数为10～ 20； (2)需氧发酵： 将步骤(1)得到的种子液接种至发酵培养基中进行需氧发酵， 发酵培养 基中OD562数至5～20后， 降低搅拌转速， 直至发酵培 养基中OD562数至30～70； (3)厌氧发酵： 当发酵培养基中OD562数至30～70后， 停止氧气补给， 使发酵培养基中氧 气浓度为0％， 开始进行厌氧发酵； 发酵厌氧阶段开始， 匀 速流加含有磷酸二氢钾10～20g/ L、 磷酸氢二钾10～20g/L、 硫酸镁1～10g/L、 钴胺素100～300mg/L的混合溶液， 并通过流加 葡萄糖溶液的方式维持发酵液中葡萄糖浓度为5～20g/L， 持续 发酵20～24h后停止发酵， 得 到发酵液。 2.根据权利要求1所述的一种高效生产L ‑缬氨酸的方法， 其特征在于， 所述种子培养基 为： 酵母粉5～20g/L， 葡萄糖10～30g/L， 磷酸氢二钾5～20g/L， 磷酸二氢钾5～20g/L， 七水 硫酸镁0.2～0.9g/L， 硫酸铵5～20g/L， 七水硫酸亚铁0.01～0.05g/L， 维生素B1 0.1～5mg/ L。 3.根据权利要求2所述的一种高效生产L ‑缬氨酸的方法， 其特征在于， 用氨水持续调节 所述种子 培养基的pH值， 使其控制在6.5～7.8。 4.根据权利要求1所述的一种高效生产L ‑缬氨酸的方法， 其特征在于， 所述发酵培养基 为： 葡萄糖20～60g/L， 酵母粉5～20g/L， 磷酸氢二钾1～10g/L， 磷酸二氢钾1～10g/L， 硫酸 铵5～10g/L， 七水硫酸镁0.5～2g/L， 七水硫酸亚铁0.01～0.05 g/L， 生物素0.1～5mg/L， 维 生素B1 0.1～5mg/L。 5.根据权利要求4所述的一种高效生产L ‑缬氨酸的方法， 其特征在于， 用氨水持续调节 所述发酵培 养基的pH值， 使其控制在6.8～8.0 。 6.根据权利要求1所述的一种高效生产L ‑缬氨酸的方法， 其特征在于， 所述需氧发酵的 发酵条件为： 温度30～ 35℃， 压力0.05～ 0.1Mpa， 风量0.2～1v/vm； 发酵培养基中OD562数至5 ～20前搅拌转速为25 0‑300rpm； 发酵培 养基中OD562数至5～20后， 搅拌转速为5 0‑100rpm。 7.根据权利要求1所述的一种高效生产L ‑缬氨酸的方法， 其特征在于， 所述厌氧发酵的 发酵条件为： 压力0.04 ‑0.06MPa， 温度3 0～35℃， 搅拌转速 50‑100r/min。 8.根据权利 要求1所述的一种高效生产L ‑缬氨酸的方法， 其特征在于， 所述步骤(3)中， 发酵厌氧阶段开始， 匀速流加混合溶 液的流加速度为3 0‑50mL/h。 9.根据权利 要求8所述的一种高效生产L ‑缬氨酸的方法， 其特征在于， 所述步骤(3)中， 发酵厌氧阶段开始， 匀速流加混合溶 液的流加速度为 40mL/h。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115197979 A 2一种高效生产L‑缬氨酸的方法 技术领域： [0001]本发明属于生物发酵工程 技术领域， 具体涉及一种高效生产L ‑缬氨酸的方法。 背景技术： [0002]L‑缬氨酸是三种支链氨基酸(BCAA)之一， 是人和动物的必需氨基酸， 在食品、 医 药、 保健品、 饲料等领域均有着重要的应用， 市场前 景非常良好。 [0003]目前， L‑缬氨酸一般采用微生物发酵法生产， 且基本都为有氧发酵法， 如专利 CN201610208596.3公布了一种通过采用溶氧两阶段控制(0 ‑18h20‑30％， 18h ‑放罐10‑ 20％)和分步补料(在发酵进行的10 ‑15h、 18‑24h、 28‑32h， 分别补加培养基玉米浆用量的 20％、 20％、 10％的灭菌玉米浆)方法， 使得转 化率提高到30‑32％； [0004]专利CN201610732888.7也 公布了一种溶氧两阶段控制(0 ‑36h20％， 36 ‑70h5％)的 L‑缬氨酸生产方法， 糖酸 转化率为40.35％； [0005]专利CN201910028347.X则通过在发酵过程中实现间歇式曝气， 使菌种处于好氧和 微氧的状态， 促进了L ‑缬氨酸的生成， 糖转 化率达到49.9％； [0006]专利CN201910136501.5也 公布了一种在溶解氧15 ‑28％条件下发酵生产L ‑缬氨酸 的方法， 该方法要求培养至6 ‑8h时流加含维生素H和钼酸铵的葡萄糖溶液， 使发酵培养液中 的葡萄糖控制在20g/L， 当发酵培养至30 ‑40h时再流加含柠檬酸盐的葡萄糖溶液， 使得L ‑缬 氨酸产量 为66‑89.4g/L， 糖酸 转化率提高到48.6％。 [0007]如上所述， L ‑缬氨酸的有氧发酵工艺开发已经很成熟， 普遍存在的缺点是菌体在 有氧呼吸过程中， 由于菌体自身的合成代谢及呼吸作用， 大量的碳源被浪费， 导致转化率偏 低； 为了满足有氧呼吸的需要， 并维持无菌环境， 就需要持续大量的制 造无菌空气， 导致能 源、 设备负担增 加。 发明内容： [0008]本发明的目的在于提供一种产酸量和糖酸转化率更高的高效生产L ‑缬氨酸的方 法。 [0009]本发明由如下技 术方案实施： 一种高效生产L ‑缬氨酸的方法， 其包括如下步骤： [0010](1)种子培养得到种子液： 以谷氨酸棒状杆菌为出发菌株， 将出发菌株接种至种子 培养基中培 养得到种子液， 控制种子液OD562数为10～ 20； [0011](2)需氧发酵： 将步骤(1)得到的种子液接种至发酵培养基中进行需氧发酵， 发酵 培养基中OD562数至5～20后， 降低搅拌转速， 进行低强度有氧发酵， 直至发酵培养基中OD562 数至30～70； [0012](3)厌氧发酵： 当发酵培养基中OD562数至30～70后， 停止氧气补给， 使发酵培养基 中氧气浓度为0％， 开始进行厌氧发酵； 发酵厌氧 阶段开始， 匀速流加含有磷酸二氢钾10～ 20g/L、 磷酸氢二钾10～20g/L、 硫酸镁1～10g/L、 钴胺素100～300mg/L的混合溶液， 并通过 流加葡萄糖溶液的方式维持发酵液中葡萄糖浓度为5～20g/L， 持续发酵20～24h后停止发说　明　书 1/6 页 3 CN 115197979 A 3