(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210708168.2 (22)申请日 2022.06.21 (71)申请人 中国科学院过程工程研究所 地址 100190 北京市海淀区中关村北二 街1 号 (72)发明人 杨茂华　邢建民　穆廷桢　苗得露　 赵胥浩　 (74)专利代理 机构 北京品源专利代理有限公司 11332 专利代理师 王艳斋 (51)Int.Cl. C12N 9/56(2006.01) C12N 9/52(2006.01) C12N 9/60(2006.01) C07K 1/34(2006.01)C12N 1/20(2006.01) C12N 1/16(2006.01) C12R 1/125(2006.01) C12R 1/19(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称 一种高效分离纯化纳豆激酶的方法及其在 制备纳豆 激酶粉中的应用 (57)摘要 本发明涉及一种高效分离纯化纳豆激酶的 方法及其在制备纳豆激酶粉中的应用， 所述方法 包括： 取纳豆激酶发酵液或纳豆激酶粗品溶液依 次进行Ⅰ级微滤处理、 Ⅱ级超滤处理和 Ⅲ级超滤 处理， 即得纯化的纳豆激酶。 本发明所涉及的分 离纯化纳豆激酶的方法简单易操作， 无需借助大 型仪器或设备， 也无需使用化学试剂， 成本低， 整 个流程耗时较 短； 且纯化得到的纳豆激酶能够长 期有效保存， 具有较高的纯度和酶活力， 非常适 合于大规模化的工业 生产。 权利要求书1页 说明书6页 CN 115094053 A 2022.09.23 CN 115094053 A 1.一种高效分离纯化纳豆激酶的方法， 其特征在于， 所述方法包括： 取纳豆激酶发酵液 或纳豆激酶粗品溶液依次进行 Ⅰ级微滤处理、Ⅱ级超滤处理和Ⅲ级超滤处理， 即得纯化的纳 豆激酶。 2.根据权利要求1所述的高效分离纯化纳豆激酶的方法， 其特征在于， 所述 Ⅰ级微滤处 理中使用的膜材 料包括平板膜、 管式膜、 卷式膜或中空纤维膜； 优选地， 所述 Ⅰ级微滤处理中使用的膜材料的材质包括醋酸纤维素、 硝酸纤维素、 混酯、 再生纤维素或聚醚砜中的任意 一种或至少两种的组合。 3.根据权利要求1或2所述的高效分离纯化纳豆激酶的方法， 其特征在于， 所述 Ⅰ级微滤 处理中使用的膜材 料的孔径为0.1 ‑0.3 μm； 优选地， 所述 Ⅰ级微滤处 理中操作压 差为0.01 ‑0.2MPa。 4.根据权利要求1 ‑3中任一项所述的高效分离纯化纳豆激酶的方法， 其特征在于， 所述 Ⅱ级超滤处 理中使用的膜材 料包括平板膜、 管式膜、 卷式膜或中空纤维膜； 优选地， 所述 Ⅱ级超滤处理中使用的膜材料的材质包括醋酸纤维素、 醋酸纤维酯、 聚乙 烯、 聚酰胺或聚砜中的任意 一种或至少两种的组合。 5.根据权利要求1 ‑4中任一项所述的高效分离纯化纳豆激酶的方法， 其特征在于， 所述 Ⅱ级超滤处 理中使用的膜材 料的孔径为0.0 3‑0.05 μm； 优选地， 所述 Ⅱ级超滤处 理中操作压 差为100‑1000kPa。 6.根据权利要求1 ‑5中任一项所述的高效分离纯化纳豆激酶的方法， 其特征在于， 所述 Ⅲ级超滤处 理中使用的膜材 料包括平板膜、 管式膜、 卷式膜或中空纤维膜； 优选地， 所述 Ⅲ级超滤处理中使用的膜材料的材质包括醋酸纤维素、 醋酸纤维酯、 聚乙 烯、 聚酰胺或聚砜中的任意 一种或至少两种的组合。 7.根据权利要求1 ‑6中任一项所述的高效分离纯化纳豆激酶的方法， 其特征在于， 所述 Ⅲ级超滤处 理中使用的膜材 料的孔径为小于 0.02 μm； 优选地， 所述 Ⅲ级超滤处 理中操作压 差为100‑1000kPa。 8.根据权利要求1 ‑7中任一项所述的高效分离纯化纳豆激酶的方法， 其特征在于， 所述 纳豆激酶发酵 液为合成纳豆 激酶的微 生物培养液； 优选地， 所述 微生物包括 枯草芽孢杆菌、 酵母菌或大肠杆菌 。 9.一种具有高酶活的纳豆激酶粉， 其特征在于， 所述具有高酶活的纳豆激酶粉由权利 要求1‑8中任一项 所述的高效分离纯化纳豆激酶的方法得到的 Ⅲ级超滤浓缩液经过冷冻干 燥处理得到。 10.根据权利要求9所述的具有高酶活的纳豆激酶粉， 其特征在于， 所述冷冻干燥处理 的温度为 ‑70～‑30℃， 时间为8 ‑72h； 优选地， 所述纳豆 激酶粉的含水量小于 5％。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115094053 A 2一种高效分离纯化纳豆激酶的方 法及其在制备纳豆激酶粉 中 的应用 技术领域 [0001]本发明属于生化分离纯化技术领域， 涉及 一种高效分离纯化纳豆激酶的方法及其 在制备纳豆激酶粉中的应用， 具体涉及一种利用膜技术高效分离纯化纳豆激酶的方法及其 在制备具有高酶活的纳豆 激酶粉中的应用。 背景技术 [0002]纳豆激酶(Nattokinase,NK)是从纳 豆发酵中分离出一种具有强纤溶活性的酶。 纳 豆激酶属于丝氨酸蛋白酶， 由275个氨基酸组成， 分子量为27.7kDa。 与其他溶栓药物相比， 纳豆激酶具有安全性高、 作用时间长、 溶栓活性好、 价格低廉等特点， 有望成为未来具有较 强市场竞争力的溶栓药物。 [0003]纳豆激酶的分离纯化一直是制约其开发应用的关键， 因此人们在纳豆激酶的分离 纯化上进行了较多的研究。 目前常用的分离纯化方法包括离心、 膜分离、 柱层析、 色谱纯化 等。 [0004]例如CN101979530A公开了一种采用乙醇沉淀粗提、 阴阳离子交换树脂层析和HPD ‑ 400大孔吸附树脂精制来分离纯化得到纳豆激酶纯品的方法， 该发明采用适于工业化生产 的柱层析填充材料， 代替了常用的昂贵的凝胶等材料， 收率可达59％， 纯度95％以上， 具有 收率高、 成本低、 可以规模化 生产的特点。 但整个流 程耗时较长， 操作相对复杂。 [0005]例如采用硫酸铵分级沉淀、 凝胶柱过滤， 虽然取得较好的分离效果， 但操作容量有 限， 生产成本高。 通过硫酸铵分级盐析法和PhenylSepharose疏水柱层析进行分离纯化， 纯 化倍数14.82， 回收率为44.03％。 但由于硫酸铵沉淀后使 得整个酶溶液的离子强度变大， 在 采用离子交换柱时一般都先要透析脱盐， 不然会对后续纯化步骤带来很大干扰， 因此往往 使得整个流 程耗时较长 。 总之， 目前的分离纯化方法都存在工业 生产困难和成本高等 缺点。 [0006]因此， 开发一种简单易操作， 且纯化后的纳豆激酶易于长期有效保存且具有较高 酶活力的纳豆 激酶分离纯化方法是非常有意 义的。 发明内容 [0007]针对现有技术的不足， 本发明的目的在于提供一种高效分离纯化纳豆激酶的方法 及其在制备纳豆激酶粉中的应用， 具体提供一种利用膜技术高效分离纯化纳豆激酶的方法 及其在制备 具有高酶活的纳豆 激酶粉中的应用。 [0008]为达到此发明目的， 本发明采用以下技 术方案： [0009]第一方面， 本 发明提供一种高效分离纯化纳豆激酶的方法， 所述方法包括： 取纳豆 激酶发酵液或纳豆激酶粗品溶液依次进 行Ⅰ级微滤处理、Ⅱ级超滤处理和Ⅲ级超滤处理， 即 得纯化的纳豆 激酶。 [0010]本发明所涉及的分离纯化纳豆激酶的方法简单易操作， 无需借助大型仪器或设 备， 也无需使用化学试剂， 成本低， 整个流程耗时较短； 且纯化得到的纳豆激酶能够长期有说　明　书 1/6 页 3 CN 115094053 A 3