(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210924359.2 (22)申请日 2022.08.03 (83)生物保 藏信息 CGMCC No.25210 202 2.06.29 (71)申请人 聊城大学 地址 252000 山东省聊城市东昌府区湖南 路1号 (72)发明人 王圣惠　郭宝源　谢金名　李晨　 岳彩旭　贾楠　 (74)专利代理 机构 青岛致嘉知识产权代理事务 所(普通合伙) 3723 6 专利代理师 高维波 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C02F 3/34(2006.01)B09C 1/10(2006.01) C12R 1/125(2006.01) C02F 101/34(2006.01) C02F 101/36(2006.01) C02F 101/38(2006.01) (54)发明名称 一种降解3， 5， 6-三氯-2 -吡啶酚的枯草芽孢 杆菌制剂及其制备方法与应用 (57)摘要 本发明涉及一种用于生物降解3， 5， 6 ‑三氯‑ 2吡啶酚 （TCP） 的枯草芽孢杆菌制剂及其制备方 法与应用， 所述菌株为枯草芽孢杆菌ZW， 保存编 号为CGMCC25210。 本发明枯草芽孢杆菌Bacillus   subtilis.ZW， 具有生长迅速、 易分离培养、 抗逆 行强和对人、 植物、 动物没有致病性， 不污染环 境， 生物安全性高等优点。 同时， 所述枯草芽孢杆 菌ZW菌体细胞在 21小时内能将初始浓度为50mg/ L的TCP降解率达72%， 具有较高的TCP降解效率， 本发明对于微生物法降解毒死蜱或TCP尤其是生 物修复毒死蜱污染的土壤及水体具有较高的应 用价值。 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 CN 115094009 A 2022.09.23 CN 115094009 A 1.一种用于生物降解TCP的芽孢杆菌， 其特征在于， 所述菌株为枯草芽孢杆菌ZW， 保存 编号为CGMCC25210。 2.如权利要求1所述的一种降解TCP的枯草芽孢杆菌菌剂， 其特征在于， 所述菌剂为液 态制剂， 芽孢杆菌 菌体细胞或芽孢浓度为1.0  x 1010  ‑3.0 x 1010 /mL。 3.如权利要求  2所述的枯草芽孢杆菌菌剂， 其特征在于， 所述菌剂为固体粉末制 剂， 芽 孢杆菌菌体细胞或芽孢的含量 为1.0 x 1010  ‑3.0 x 1010/g。 4.按照权利要求2或3所述的枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法， 其特征在于： 包括如下步 骤： 1） 将保藏的如权利要求1所述的枯 草芽孢杆菌ZW菌株接种于发酵培 养基中活化两代； 2） 将活化好的菌株接种于含有TCP(50mg/L)的发酵液体培养基中， 振荡培养至对数生 长期， 获得枯 草芽孢杆菌的发酵培 养物； 3） 对枯草芽孢杆菌的发酵培养物进行离心分离处理， 收获枯草芽孢杆菌的菌体细胞或 芽孢。 5.按照权利要求 4所述的制备 方法， 其特 征在于： 所述的发酵培 养基组分为： 蛋白胨： 10  g/L； 酵母膏： 5  g/L； NaCl： 10  g/L； pH： 7.0； 所述培 养温度为3 5℃。 6.如权利要求2或3所得降解TCP的枯草芽孢杆菌菌剂在降解TCP中的应用， 其特征在 于： 1） 使用PBS缓冲液对冷冻干燥后的枯草芽孢杆菌制剂进行稀释， 制成用于降解TCP的液 态菌剂； 2） 使用海藻糖、 甘油和可溶性淀粉对冷冻干燥后的枯草芽孢杆菌制剂进行复配稀释， 制成用于降解TCP的固态菌剂。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115094009 A 2一种降解3， 5， 6 ‑三氯‑2‑吡啶酚的枯草芽孢杆菌制剂及其制 备方法与应用 技术领域 [0001]本发明属于微生物降解农药残留领域， 涉及一种用于生物降解3， 5， 6 ‑三氯‑2吡啶 酚 （TCP） 的枯 草芽孢杆菌制剂及其制备 方法与应用。 背景技术 [0002]毒死蜱 （Chlorpyrios） 是一种中等毒性的有机磷农药， 主要用于水稻、 玉米、 蔬菜、 果树及茶树的病虫害防治。 由于毒死蜱的大量生产和超量使用， 在农业生产环境和农产品 中， 毒死蜱的高毒、 难降解残留物TCP的污染问题日趋严重 。 [0003]TCP具有环境毒性， 其对土壤微生物的毒性是毒死蜱的2.5倍。 研究发现， 如果TCP 含量过高 （>100  mg/L） 会阻滞毒死蜱以及其它有机污染物的降解， 进而影响生态环境系统 的自我调节及修复功能。 TCP对非靶标生物存在潜在危险， 低浓度TCP便对水生生物和陆生 生物产生中等毒性。 TCP对 人体也会产生危害， 它不仅能够降低男性精子的质量和体内睾丸 素合成的速率从而影响人体的生殖性能， 还能引发青春期女性的睡眠呼吸障碍， 最终影响 其后代在婴儿期及以后的睡眠。 目前， TCP已被美国环 境保护局认定为 持久性和移动性有毒 农药代谢产物， 并且在英国TCP也被列入危险指数最高的有 毒代谢产物。 [0004]微生物降解是消除农药残留的有效手段， 它具有安全、 成本低、 无二次污染等优 点。 目前国内外已有TCP降解菌株的报导。 如， 徐明刚等从山东某农药污水处理厂活性污泥 中筛选出一株能够利用毒死蜱和TCP作为碳、 磷和氮源用于自身生长的菌株副球菌属 Paracoccus  sp. strain TRP， 李晓楼在对微生物降解甲基毒死蜱的研究中分离得到一株 能够降解TCP的菌株荧光假单胞菌 Pseudomonas  fluoresc ens ZHLXL‑2， 目前国内外分离的 TCP降解菌株少， 降解能力偏低等问题。 本发明以长期施用毒 死蜱农药的韭菜田土壤作为菌 种来源， 从中筛选高效降解TCP的菌株。 枯草芽孢杆菌 （ Bacillus  subtilis ） 是一类产生芽 孢的革兰氏阳性菌株， 具有生长迅速、 易分离培养、 抗逆行强和对人、 植物、 动物没有致病 性， 不污染环 境， 生物安全性高等优点。 因此， 本发 明对于微生物法降解毒 死蜱或TCP尤其是 生物修复毒死蜱污染的土壤及水体具有较高的应用价 值。 发明内容 [0005]本发明的第一个目的是针对现有的TCP高效降解菌株少， 降解能力低等问题， 提供 一种用于高效降解TCP的枯草芽孢杆菌， 该菌株的菌体细胞或芽孢对环境安全， 且均能高效 降解TCP， 在修复毒死蜱或TCP污染的土壤及水体方面具有重要的应用前 景。 [0006]本发明的第二个目的是提供一种降解TCP的枯草芽孢杆菌制剂及其应用， 所述的 枯草芽孢杆菌制剂由上述用于降解TCP的芽孢杆菌制成， 能够高效生物降解TCP。 [0007]本发明第一方面提供了一种用于降解TCP的枯草芽孢杆菌， 该菌株为革兰氏阳性， 好氧， 没有 荚膜， 有周生鞭毛， 可以运动； 生长较迅速、 代谢旺盛、 抗逆性 强； 在固体培养基上 生长时， 菌落的表面粗糙， 呈污白或微黄 色， 有时会形成褶皱； 在液体培养基中生长时， 有时说　明　书 1/4 页 3 CN 115094009 A 3