(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210984367.6 (22)申请日 2022.08.15 (71)申请人 广西大学 地址 530004 广西壮 族自治区南宁市西乡 塘大学东路100号广西大学轻工与食 品工程学院 (72)发明人 李全阳　张钦任　 (51)Int.Cl. C12N 1/02(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种长寿老人源双歧杆菌分离鉴定的方法 (57)摘要 双歧杆菌作为一种典型的益生菌， 广泛存在 于人体肠道和母乳样品， 但其在长寿老人粪便样 品中的丰度显著低于婴儿粪便样 本， 加上严格厌 氧的属性， 使得长寿老人源双歧杆菌的分离培养 极其困难， 相关研究开发进展缓慢。 本发明给出 一种长寿老人源双歧杆菌分离鉴定的方法， 属于 微生物技术领域。 采用的培养基是以TPY培养基 为基础进行改良的选择性培养基。 所述的改良 TPY包括抗生素莫匹罗 星、 生物调控因子A、 显色 剂X‑Gal和生长调控因子B。 本发明的改良TPY能 选择性地抑制粪便样品中的革兰氏阴性菌， 且对 双歧杆菌的生长具有促进作用， 使得其在平板表 面生长出显蓝色的典型菌落， 可显著降低复杂混 合样品中双歧杆菌的分离难度， 对双歧杆菌的筛 选培养具有实用价 值。 权利要求书2页 说明书6页 附图3页 CN 115216410 A 2022.10.21 CN 115216410 A 1.一种长寿老人源双歧杆菌分离鉴定的方法， 其特征在于， 所述的分离鉴定方法采用 的是平板稀释涂布法。 2.如权利要求1所述的长寿老人源双歧杆菌分离鉴定的方法， 其特征在于， 所述的分离 鉴定方法采用的是改良TPY 选择性培 养基。 3.如权利要求1所述的长寿老人源双歧杆菌分离鉴定的方法， 其特征在于， 所述的改良 TPY配方包括 抗生素莫匹罗星和生物调控因子A。 4.如权利要求1所述的长寿老人源双歧杆菌分离鉴定的方法， 其特征在于， 所述的改良 TPY配方包括显色剂X ‑Gal。 5.如权利要求1所述的长寿老人源双歧杆菌分离鉴定的方法， 其特征在于， 所述的改良 TPY配方包括 生长因子生长调控因子B。 6.如权利要求1所述的长寿老人源双歧杆菌分离鉴定的方法， 其特征在于， 所述的改良 TPY培养基配方为酪蛋白10g/L、 大豆蛋白胨5g/L、 酵母浸粉2g/L、 葡萄糖5g/L、 吐温 ‑80 1g/ L、 L‑半胱氨酸0.5g/L、 磷酸氢二钾2g/L、 氯化镁0.5g/L、 硫酸锌0.2 5g/L、 氯化钙0.15g/L、 莫 匹罗星10 0mg/L、 生物调控因子A  100mg/L、 X‑Gal 60mg/L、 生长调控因子B  1mg/L。 7.如权利要求5所述的长寿老人源双歧杆菌分离鉴定的方法， 其特征在于， 所述的改良 TPY选择性培 养基的配制方法为： S1： 抗生素溶液的配制： 将莫匹罗星溶于无菌超纯水， 配制成50mg/mL的溶液， 将生物调 控因子A溶于1M  NaOH， 配制成5 0mg/mL的溶 液， 过滤除菌放置4℃冰箱备用； S2： 显色剂和生长因子溶液的配制： 将X ‑Gal溶于二甲基甲酰胺， 配制成20mg/mL的溶 液， 将生长调控因子B溶于无水乙醇， 配制成10 mg/mL的溶液， 过滤除菌放置4℃冰箱备用(避 光保藏)； S3： L‑半胱氨酸的配制： 将L ‑半胱氨酸溶解于蒸馏水， 得到20％(W/V)的L ‑半胱氨酸溶 液， 过滤除菌备用； S4： 无机盐溶液的配制： 将K2HPO4溶解于蒸馏水， 得到50％(W/V)的K2HPO4溶液， 将MgCL2 溶解于蒸馏水， 得到50％(W/V)的MgCL2溶液， 将ZnSO4溶解于蒸馏水， 得到25％(W/V)的ZnSO4 溶液， 将CaCL2溶解于蒸馏水， 得到15％(W/V)的CaCL2溶液， 121℃高压蒸汽灭菌20min后备 用； S5： 取酪蛋白10g， 大豆蛋白胨5g， 酵母浸粉2g， 葡萄糖5g， 吐温 ‑80 1g， 琼脂15g， 定容于 1L蒸馏水中， 混合均匀后将其按照每个锥形瓶200mL进行分装， 121℃高压蒸汽灭菌20min， 待其冷却至55℃左右(摸着有一点 烫手)时， 随后往锥形瓶添加S1 中的莫匹罗星和生物调控 因子A溶液各200 μL， S2中的X ‑gal溶液600 μL和生长调 控因子B溶液200 μL， S3中的L ‑半胱氨 酸溶液200 μL， S4中的K2HPO4溶液800 μL， MgCL2溶液、 ZnSO4溶液和CaCL2溶液各200 μL， 添加之 后将锥形瓶轻微摇晃， 使之混合均匀， 静置一小会待里面气泡消失， 然后开始倒平板， 得到 改良TPY选择性培 养基。 8.如权利要求1所述的长寿老人源双歧杆菌分离鉴定的方法， 其特征在于， 所述的筛选 培养基为pH值 为6.5。 9.如权利要求1所述的长寿老人源双歧杆菌分离鉴定的方法， 其特征在于， 所述的筛选 培养采用的培 养温度为37℃。 10.如权利要求1所述的长寿老人源双歧杆菌分离鉴定的方法， 其特征在于， 所述的筛权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115216410 A 2选培养采用的混合气体 配比为90％N2、 5％H2、 5％CO2。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115216410 A 3