(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210802315.2 (22)申请日 2022.07.07 (66)本国优先权数据 202210371800.9 2022.04.11 CN (71)申请人 河北工业大 学 地址 300401 天津市北辰区西平 道5340号 (72)发明人 吴志能　马小东　牛韩宇　满全莉　 (74)专利代理 机构 天津翰林知识产权代理事务 所(普通合伙) 12210 专利代理师 付长杰 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12P 3/00(2006.01) C12P 39/00(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种铁还原菌 群及其应用 (57)摘要 本发明为一种铁还原菌群及其应用， 该铁还 原菌群利用污染土壤为菌株筛选的源土壤， 采用 柠檬酸铁培养基进行富集培养， 最终获得铁还原 菌群， 所述铁还原菌群在属水平上的组成主要包 括Enterobacter、 Shewanella、 Acinetobacter、 Petrimonas、 Aeromonas。 所述铁还原菌群应用在 除磷中， 在 柠檬酸铁培养基中还原Fe(III)， 在1 ‑ 2天内能快速合成蓝铁矿， 实现对水体中磷的高 效去除。 权利要求书2页 说明书9页 附图2页 CN 114921388 A 2022.08.19 CN 114921388 A 1.一种铁还原菌群， 其特征在于， 该铁还原菌群利用污染土壤为菌株筛选的源土壤， 采 用柠檬酸铁培养基进行富集培养， 最终获得铁还原菌群， 所述铁还原菌群在属水平上 的组 成主要包括Enterobacter、 Shewanel la。 2.一种铁还原菌群， 其特征在于， 所述铁还原菌群包括Enterobacter、 Shewanella两种 菌属， 尤其是包 括Shewanellaoneiden sisstrainMR ‑1或ShewanellaputrefaciensCN32中的 至少一种和EnterobacteraerogenesXM2， 铁还原菌群中Enterobacter、 Shewanella两种菌 属的质量比为3 ‑6:1， 以该铁还原菌群用于快速合成蓝 铁矿。 3.一种快速生物合成蓝 铁矿方法， 其特 征在于， 该 方法的具体步骤是： 步骤1采自污染场地的污染土壤， 将污染土壤冰盒保存， 24小时内带回实验室， 放入厌 氧培养箱内， 用于铁还原菌群的富集； 所述污染土壤中含有土著厌氧铁还原微生物和腐殖 质， 污染土壤中包含4 ‑氯苯胺、 苯并[a]芘、 苯酚、 邻(对)硝基氯苯中的至少一种， 且包含卤 代烃(1,2 ‑二氯乙烷、 三氯乙烯、 苯酚、 二氯乙烯、 氯乙烯)中的至少一种污染物； 步骤2所述的铁还原菌群的富集过程为： 富集培养实验在厌氧手套箱中进行， 实验采用 40mL培养瓶， 称取5 ‑20g污染土壤样品加入到装有20 ‑80mL经高温灭菌 冷却后的生理盐水的 容器中， 充分涡旋混匀后， 在厌氧箱 中静置1‑5h； 将涡旋混匀静置后的1 ‑6mL的土壤悬浊液 和5‑30mL柠檬酸铁培养基加入40mL透明培养瓶中， 25 ‑35℃恒温避光在 厌氧培养箱中培养， 每隔一天摇匀， 待溶液颜色由棕黄色变成蓝黑色时， 取培养瓶中的菌悬液转接至新的柠檬 酸铁培养基中富集培养， 待 溶液颜色再次由棕黄 色变成蓝黑色时， 连续转接富集培养3 ‑5次 后获得铁还原菌群； 所述柠檬酸铁培养基组分为： 2.5 ‑3.5g/L柠檬酸铁、 1g/LNH4Cl、 0.07g/LCaCl2·2H2O、 0.6g/LMgSO4·7H2O、 0.722g/LK2HPO4·3H2O、 0.25g/LKH2PO4、 0.5‑2g/L葡萄糖、 0.5 ‑1.5mL微 量元素储备液、 1 ‑3mL维生素溶液、 0.0771g/LDL ‑dithiothreitol； 用1mol/LHCl和1mol/ LNaOH调节pH＝7.0 ‑7.4， 培养基高压灭菌冷却后备用； 微量元素储备液组分： 10mL/LHCl、 1.5g/LFeCl2·4H2O、 0.19g/LCoCl2·6H2O、 0.1g/ LMnCl2·4H2O、 0.07g/LZnCl2、 0.006g/LH3BO3、 0.036g/LNa2MoO4·2H2O、 0.024g/LNiCl2· 6H2O、 0.002g/LCuCl2·2H2O； 维生素溶液组分： 0.00002g/L生物素、 0.00002g/L维生素B、 0.0001g/L盐酸吡哆醇、 0.00005g/L核黄素、 0.00005g/L维生素B1、 0.00005g/L烟酸、 0.00005g/L泛酸、 0.00005g/L 对氨基苯甲酸、 0.0 0005g/L硫辛 酸、 0.000001g/L维生素B12； 步骤3铁还原菌群扩大培养合成蓝铁矿： 实验在厌氧培养箱中进行， 将步骤2中富集获 得的铁还原菌群在液体LB培养基中培养至对 数期， 用0.8 5％的生理盐水进 行离心清洗3次， 并用生理盐水悬浮； 在40mL培养瓶中， 接入10 ‑20mL柠檬酸铁培养基， 然后接入1 ‑4mL用 0.85％的生理盐水悬浮的对 数期菌液， 将培养瓶置于厌 氧培养箱内25 ‑35℃恒温培养， 培养 1‑2d， 观察培 养基颜色由棕黄色变为蓝黑色， 表明铁还原菌群还原F e(III)合成了 蓝铁矿。 4.根据权利要求1所述的快速生物合成蓝铁矿方法， 其特征在于， 所述铁还原菌群在属 水平上的组成主要包括Enterobacter、 Shewanella、 Acinetobacter、 Petrimonas、 Aeromonas。 5.根据权利要求1所述的铁还原菌群， 其特征在于， 所述铁还原菌群在属水平上的主要 组成为： Enterobacter、 Shew anella、 Acinetobacter、 Petrimonas、 Aeromon as， 五者的相对权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114921388 A 2丰度依次为 49％、 13％、 12％、 1 1％、 5％。 6.一种快速生物合成蓝 铁矿方法， 其特 征在于， 该 方法包括以下步骤： 采用购买的标准土壤样品GBW07405(GSS ‑5)， 加入有机污染物和腐殖酸， 同时加入铁还 原菌群， 在铁还原菌群和复合污染物作用下， 土壤样品进 行染毒老化7 ‑10天处理， 形成污染 土壤； 所述有机污染物为包含4 ‑氯苯胺、 苯并[a]芘、 苯酚、 邻(对)硝 基氯苯中的至少一种， 且 包含卤代烃(1,2 ‑二氯乙烷、 三氯乙烯、 苯酚、 二氯乙烯、 氯乙烯)中的至少一种的污染物， 构 成污染土壤； 所述铁还原菌群， 包括至少1种Shewanellasp.(Shewanellaoneidensisstr ainMR‑1或 ShewanellaputrefaciensCN32)和1种Enterobactersp.(EnterobacteraerogenesXM2)， 铁 还原菌群中Enterobacter、 Shewanel la两种菌属的质量比为3 ‑6:1； 铁还原菌群的富集过程为： 富集培养实验在厌氧手套箱中进行， 实验采用40mL培养瓶， 称取5‑20g污染土壤样品加入到装有20 ‑80mL经高温灭菌 冷却后的生理盐水的容器中， 充分 涡旋混匀 后， 在厌氧箱中静置1 ‑5h； 将涡旋混匀静置后的1 ‑6mL的土壤悬浊液和5 ‑30mL柠檬 酸铁培养基加入40mL透明培养瓶中， 25 ‑35℃恒温避光在厌氧培养箱中培养， 每隔一天摇 匀， 待溶液颜色由棕黄色变成蓝黑色时， 取培养瓶中的菌悬液转接至新的柠檬酸铁培养基 中富集培养， 待 溶液颜色再次由棕黄 色变成蓝黑色时， 连续转接富集培养3 ‑5次后获得铁还 原菌群； 铁还原菌群扩大培养合成蓝铁矿： 实验在厌氧培养箱中进行， 将富集获得的铁还原菌 群在液体LB培养基中培养至对 数期， 用0.8 5％的生理盐水进 行离心清洗3次， 并用生理盐水 悬浮； 在40mL培养瓶中， 接入10 ‑20mL柠檬酸铁培养基， 然后接入1 ‑4mL用0.85％的生理盐水 悬浮的对数期菌液， 将培 养瓶置于厌氧培 养箱内25 ‑35℃恒温培 养， 培养1‑2d， 生成蓝 铁矿。 7.根据权利要求6所述的快速生物合成蓝铁矿方法， 其特征在于， 所述卤代烃为三氯甲 烷、 1,2‑二氯乙烷、 三氯乙烯、 氯苯中的至少一种。 8.根据权利要求6所述的快速生物合成蓝铁矿方法， 其特征在于， 所述卤代烃在土壤中 的含量为50‑120mg/kg。 9.根据权利要求6所述的快速生物合成蓝铁矿方法， 其特征在于， 4 ‑氯苯胺、 苯并[a] 芘、 邻(对)硝基氯苯、 苯酚在土壤中的浓度分别为： 10 ‑30mg/kg、 1.5 ‑5.5mg/kg、 32 ‑95mg/ kg、 500‑1100mg/kg。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114921388 A 3