(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211047985.4 (22)申请日 2022.08.30 (71)申请人 浙江大学 地址 310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘 路866号 (72)发明人 李翔　周成　朱佩佩　傅译可　 (74)专利代理 机构 杭州求是专利事务所有限公 司 33200 专利代理师 邱启旺 (51)Int.Cl. A61K 35/74(2015.01) A61K 33/08(2006.01) A61K 33/24(2019.01) A61P 35/00(2006.01) C12N 1/20(2006.01)C12N 1/04(2006.01) C01G 51/00(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种钴铝双氢氧化物/丙酸杆菌杂化材料及 其制备和应用 (57)摘要 本发明公开了一种钴铝双氢氧化物/丙酸杆 菌杂化材料及其制备和应用， 包括： 痤疮丙酸杆 菌扩增培养； 使用共沉淀 法制备钴铝层状双金属 氢氧化物； 将 钴铝层状双金属氢氧化物和痤疮丙 酸杆菌的分散液以一定比例混合， 振 荡后离心清 洗得到钴铝层状双金属氢氧化物改性的痤疮丙 酸杆菌杂化材料。 该方法通过纳米材料与微生物 的杂化实现了对肿瘤的高效治疗， 痤疮丙酸杆菌 是厌氧耐氧型微生物， 响应肿瘤乏氧环境原位代 谢产生一氧化氮气体分子， 与钴铝层状双金属氢 氧化物降解产生的钴离子协同作用产生强氧化 性的过氧亚硝基阴离子杀伤肿瘤， 同时痤疮丙酸 杆菌可以促进巨噬细胞转型， 激活免疫， 提高了 肿瘤气体疗法和免疫 疗法的协同效果。 权利要求书1页 说明书7页 附图7页 CN 115487212 A 2022.12.20 CN 115487212 A 1.一种钴铝 双氢氧化物/丙酸杆菌杂化材 料的制备 方法， 其特 征在于， 包括： (1)将ATCC  11827痤疮丙酸杆菌菌种的冻干粉加入到液体培养基中振荡培养48h， 取培 养液在琼脂固体培养基上涂板得到单克隆菌落， 再将固体培养基中挑取单克隆菌落在液体 培养基中扩增28 ‑36h， 将培养液与甘油以7： 3的体积比混合分装于灭菌的离心管中， 置于 ‑ 80℃低温冰箱中保存， 即得到 痤疮丙酸杆菌冻存液； (2)水浴解冻痤疮丙酸杆菌冻存液， 将解冻后的痤疮丙酸杆菌冻存液在液体培养基中 振荡20‑28h后分散在超纯 水中， 使其浓度为108CFU/mL时得到 痤疮丙酸杆菌分散液； (3)将25％氨水与超纯水以体积比1:25的比例混合制备溶液A， 将Co(NO3)2·6H2O和Al (NO3)3·9H2O以Co/Al的摩尔比2:1的比例溶于超纯水中制备溶液B， 所述Co(NO3)2·6H2O和 Al(NO3)3·9H2O的总质量与超纯水的质量比为1： 2 5‑30； 在2800‑3600rpm的搅拌下以20mL/h 的恒定速率将溶液B加入到溶液A中得到其产物， 对产物进行超声和清洗， 最后将产物分散 在超纯水中得到钴铝 层状双金属氢 氧化物胶体； (4)将步骤(2)得到的痤疮丙酸杆菌分散液和步骤(3)得到的钴铝层状双 金属氢氧化物 胶体以109CFU和100 μg的比例混合， 振荡、 离心和清洗得到钴铝层状双金属氢氧化物改性痤 疮丙酸杆菌生物杂化材 料。 2.根据权利要求1所述的一种 钴铝双氢氧化物/丙酸杆菌杂化材料的制备方法， 其特征 在于， 所述步骤(2)中水浴解冻痤疮丙酸杆菌冻存液为利用37℃水浴快速解冻， 然后再使 用。 3.根据权利要求1所述的一种 钴铝双氢氧化物/丙酸杆菌杂化材料的制备方法， 其特征 在于， 所述 步骤(2)中痤疮丙酸杆菌振荡培 养的速率 为100‑200rpm， 温度为37℃。 4.根据权利要求1所述的一种 钴铝双氢氧化物/丙酸杆菌杂化材料的制备方法， 其特征 在于， 所述 步骤(3)中产物的超声时间为1小时， 频率 为40kHz； 且需超纯 水清洗两遍。 5.根据权利要求1所述的一种 钴铝双氢氧化物/丙酸杆菌杂化材料的制备方法， 其特征 在于， 所述 步骤(4)中振荡速率 为100‑200rpm， 振荡时间为的10 ‑20min。 6.一种由权利要求1 ‑5任一项所述的制备方法制备得到的钴铝层状双金属氢氧化物/ 痤疮丙酸杆菌生物杂化材 料。 7.根据权利要求6所述的钴铝层状双金属氢氧化物/痤疮丙酸杆菌生物杂化材料在制 备肿瘤的气体分子治疗剂和免疫 治疗剂中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115487212 A 2一种钴铝双氢氧化物/丙 酸杆菌杂化材料及其制备和应用 技术领域 [0001]本发明涉及生物杂化材料领域， 尤其涉及一种钴铝双氢氧化物/丙酸杆菌杂化材 料及其制备和应用。 背景技术 [0002]癌症如今已经成为威胁人类健康和生命最主要的疾病之一， 临床上常规的癌症治 疗方法主要包括手术治疗、 放疗和化疗， 都具有一定的局限性。 手术治疗只能针对实体瘤， 无法有效应对转移瘤， 且难以根除肿瘤。 放疗和化疗的副作用明显， 对正常组织损伤较大。 随着研究的逐渐深入， 工程化微生物应用于肿瘤治疗展现出出色的潜力， 微生物在长期的 自然选择中进化出了特殊的功能， 包括肿瘤靶向性、 免疫作用、 抗肿瘤代谢物的产生等， 并 且微生物可以在肿瘤组织定植、 增殖， 干预肿瘤的代谢， 抑制肿瘤生长， 可以用于开发全新 的抗肿瘤体系， 克服传统治疗方式的缺点。 但是， 微生物易被免疫系统识别而清除， 降低治 疗效果， 同时微生物的代谢行为可能产生毒性副的产 物。 因此， 开 发一种新型的微生物肿瘤 治疗体系， 降低治疗过程中的副作用， 提升对肿瘤组织的杀伤能力， 是一项意义重大的工 作。 发明内容 [0003]本申请是针对现有技术的不足， 提供一种钴铝层状双金属氢氧化物/痤疮丙酸杆 菌生物杂化材料及其制备方法、 应用， 以解决常规肿瘤 治疗方法靶向性弱， 副作用强且对肿 瘤转移效果有限的问题。 [0004]根据本申请实施例的第一方面， 提供一种钴铝双氢氧化物/丙酸杆菌杂化材料的 制备方法， 包括： [0005](1)将ATCC  11827痤疮丙酸杆菌菌种的冻干粉加入到液体培养基中振荡培养48h， 取培养液在琼脂固体培养基上涂板得到单克隆菌落， 再将固体培养基中挑取单克隆菌落在 液体培养基中扩增28 ‑36h， 将培养液与甘油以7： 3的体积比混合分装于灭菌的离心管中， 置 于‑80℃低温冰箱中保存， 即得到 痤疮丙酸杆菌冻存液； [0006](2)水浴解冻痤疮丙酸杆菌冻存液， 将解冻后的痤疮丙酸杆菌冻存液在液体培养 基中振荡20 ‑28h后分散在超纯 水中， 使其浓度为108CFU/mL时得到 痤疮丙酸杆菌分散液； [0007](3)将25％氨水与超纯水以体积比1:25的比例混合制备溶液A， 将Co(NO3)2·6H2O 和Al(NO3)3·9H2O以Co/Al的摩尔比2:1的比例溶于超纯水中制备溶液B， 所述Co(NO3)2· 6H2O和Al(NO3)3·9H2O的总质量与超纯水的质量比为1： 25 ‑30； 在2800 ‑3600rpm的搅拌下以 20mL/h的恒定速率将溶液B加入到溶液A中得到其产物， 对产物进行超声和清洗， 最后将产 物分散在超纯 水中得到钴铝 层状双金属氢 氧化物胶体； [0008](4)将步骤(2)得到的痤疮丙酸杆菌分散液和步骤(3)得到的钴铝层 状双金属氢氧 化物胶体以109CFU和100 μg的比例混合， 振荡、 离心和清洗得到钴铝层状双金属氢氧化物改 性痤疮丙酸杆菌生物杂化材 料。说　明　书 1/7 页 3 CN 115487212 A 3