(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210821769.4 (22)申请日 2022.07.13 (71)申请人 通辽梅花生物科技有限公司 地址 028024 内蒙古自治区通辽市科尔沁 区木里图工业园区 (72)发明人 孔凡明　王玉杰　吴涛　高鹏　 常利斌　龚华　李岩　赵津津　 (74)专利代理 机构 内蒙古欣洋 瑞专利代理有限 公司 151 10 专利代理师 刘彩霞 (51)Int.Cl. C12P 19/32(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12N 9/10(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 一种采用核苷磷酸化 酶催化鸟苷生产5 ′-鸟 苷酸二钠的方法 (57)摘要 本发明公开了一种采用核苷磷酸化酶催化 鸟苷生产5' ‑鸟苷酸二钠的方法， 将核苷磷酸化 酶酶液接入装有反应底物的转化罐中进行转化 反应得到5' ‑鸟苷酸二钠； 其中， 所述反应底物为 由鸟苷、 多聚磷酸盐和水制备的悬浊液， 所述反 应底物中鸟苷的质量百分比浓度为10 ‑12％； 所 述反应底物中多聚磷酸盐的质量百分比浓度为 15‑20％； 所述核苷磷酸化酶酶液的接入量为所 述反应底物质量的10 ‑12％； 转化温度为32℃， 转 化pH为5.0， 转化时间为20h。 本发明通过调整核 苷磷酸化 酶酶液的添加量、 底物添加量和转化过 程工艺控制(转化温度、 转化pH和转化时间)， 改 变体系黏度， 抑制逆反应， 从而提高鸟苷摩尔转 化率。 权利要求书1页 说明书7页 CN 114958944 A 2022.08.30 CN 114958944 A 1.一种采用核苷磷酸化酶催化鸟苷生产5' ‑鸟苷酸二钠的方法， 其特征在于， 将核苷磷 酸化酶酶液接入装有反应底物的转化罐中进 行转化反应得到5' ‑鸟苷酸二钠； 其中， 所述反 应底物为由鸟苷、 多聚磷酸盐和水制备 的悬浊液， 所述反应底物中鸟苷的质量百分比浓度 为10‑12％； 所述反应底物中多聚磷酸盐 的质量百分比浓度为15 ‑20％； 所述核苷磷酸化酶 酶液的接入量为所述反应底物质量的10 ‑12％； 转化 温度为32℃， 转化pH为5.0， 转化时间为 20h。 2.根据权利要求1所述的一种采用核苷磷酸化酶催化鸟苷生产5' ‑鸟苷酸二钠的方法， 其特征在于， 所述多聚磷酸盐为焦磷酸盐、 三聚磷酸盐或六偏磷酸盐中的任意一种或几种 的组合。 3.根据权利要求2所述的一种采用核苷磷酸化酶催化鸟苷生产5' ‑鸟苷酸二钠的方法， 其特征在于， 所述多聚磷酸盐为焦磷酸钠、 六偏磷酸钠和三聚磷酸钠， 且所述焦磷酸钠、 所 述六偏磷酸钠和所述 三聚磷酸钠的质量比为1： 1： 1。 4.根据权利要求1 ‑3任一所述的一种采用核苷磷酸化酶催化鸟苷生产5' ‑鸟苷酸二钠 的方法， 其特征在于， 所述核苷磷酸化酶酶液按如下步骤制备得到： (1)种子培养得到种子 液； (2)种子液接种至发酵培养基中发酵培养得到核苷磷酸化酶发酵液； (3)利用核苷磷酸 化酶发酵 液制备得到核苷磷酸 化酶酶液； 其中， (1)种子培养得到种子液： 将平板活化的大肠杆菌接入摇瓶种子培养基中， 培养至OD600 达到4.0‑12.0得到种子液； 其中， 种子培养条件为： 初始pH值为6.6 ‑7.2， 摇床转速为150 ‑ 250rpm， 培养温度为3 0‑37℃； (2)种子液接种至发酵培养基中发酵培养得到核苷磷酸化酶发酵液： 按5 ‑10％接种比 例将所述种子液接入发酵培养基中发酵培养至OD600达到60‑100放罐， 得到核苷磷酸化 酶发 酵液； 其中， 发酵罐发酵条件为： 罐压为0.05 ‑0.1Mpa， 通气量为5 ‑20L/min， 搅拌转速为200 ‑ 800rpm， pH值为6.6 ‑7.2， 发酵前20h的发酵温度为35℃， 发酵20 ‑40h的发酵温度为30℃； 通 过依次循环调节罐压、 通气量、 搅拌转速， 使溶 氧维持在3 0‑40％； (3)利用核苷磷酸化酶发酵液制备得到核苷磷酸化酶酶液： 将核苷磷酸化酶发酵液在 转速为5000 ‑10000rpm下离心5 ‑20min去除上清液， 然后加超纯水重新定容回原核苷磷酸化 酶发酵液体积， 得到核苷磷酸 化酶酶液。 5.根据权利要求4所述的一种采用核苷磷酸化酶催化鸟苷生产5' ‑鸟苷酸二钠的方法， 其特征在于， 所述种 子培养基组成为： 葡萄糖5 ‑20g/L、 酵母浸粉3 ‑10g/L、 玉米浆5 ‑10g/L、 蛋白胨2‑5g/L、 谷氨酸钠1 ‑5g/L、 硫酸镁1 ‑2.5g/L、 磷酸氢二钾0.5 ‑1.0g/L、 消泡剂0.5 ‑ 2mL/L， 其 余为水。 6.根据权利要求4所述的一种采用核苷磷酸化酶催化鸟苷生产5' ‑鸟苷酸二钠的方法， 其特征在于， 所述发酵培养基组成为： 葡萄糖20 ‑100g/L、 酵母浸粉5 ‑10g/L、 玉米浆10 ‑30g/ L、 硫酸铵2 ‑5g/L、 磷酸氢二钾2 ‑5g/L、 硫酸镁0.2 ‑0.6g/L、 生物素0.02 ‑0.1g/L、 VB1  0.01‑ 0.05g/L、 消泡剂0.5 ‑2mL/L， 其 余为水。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114958944 A 2一种采用核 苷磷酸化酶催化鸟苷生产 5′ ‑鸟苷酸二钠的方 法 技术领域： [0001]本发明属于核苷酸生产技术领域， 具体涉及一种采用核苷磷酸化酶催化鸟苷生产 5'‑鸟苷酸二钠的方法。 背景技术： [0002]5'‑鸟苷酸二钠(Disodium  guanosine ‑5’ ‑monophosphate， 简称GMP)属于呈味核 苷酸的一种， 具有香菇特有的鲜味， 鲜味强度为肌苷 酸二钠(简称IMP)的2.3倍。 其作为鲜味 剂广泛应用于食品加工过程， 通常与5' ‑肌苷酸二钠按质量比1： 1混合制备成呈味核苷酸I + G。 I+G与谷氨 酸钠混合具有很强的鲜味协同效应， 混合后鲜味可增强数倍， 大大减少鲜味剂 用量， 提高鲜味剂的安全性和经济性。 [0003]目前5'‑鸟苷酸二钠的生产方法有化学合成法和酶转化法。 化学合成法生产5' ‑鸟 苷酸二钠工艺一般将鸟苷悬浮于磷酸烷基酯溶剂 中， 采用三氯氧磷作为磷酸化试剂， 不需 要对鸟苷进行保护， 直接磷酸化生成5' ‑鸟苷酸二钠。 化学合成法生产环境恶劣， 对生产人 员健康和环境危害较大， 并且化学合成方法所用的化学试剂较昂贵， 成本较高。 酶转化法主 要是利用核苷磷酸化 酶催化鸟苷磷酸化生 成5'‑鸟苷酸二钠。 酶转化法具有 特异性高、 反应 条件温和、 无毒和成本低等优点， 相比化学合成法发展潜力巨大。 [0004]在I+G实际生产过程中一般要求鸟 苷摩尔转化率＞95％， 鸟 苷量＜5g， 在后续提取 过程中才可通过脱色和析磷过程去除多余的鸟苷， 从而使I+G产品达到质量要求。 目前酶转 化法， 鸟苷在酶催 化过程存在转化体系粘稠、 容易出现逆反应导致鸟苷摩尔转化率低， 不能 满足I+G产品对5' ‑鸟苷酸二钠的质量要求。 发明内容： [0005]本发明的目的在于提供一种鸟苷摩尔转化率更高的采用核苷磷酸化酶催化鸟苷 生产5'‑鸟苷酸二钠的方法。 [0006]本发明由如下技术方案实施： 一种采用核苷磷酸化酶催化鸟苷生产5' ‑鸟苷酸二 钠的方法， 将核苷磷酸化酶酶液接入装有反应底物的转化罐中进行转化反应得到5' ‑鸟苷 酸二钠； 其中， 所述反应底物为由鸟苷、 多聚磷酸盐和水制备的悬浊液， 所述反应底物中鸟 苷的质量百分比浓度为10 ‑12％； 所述反应底物中多聚磷酸盐的质量百分比浓度为15 ‑ 20％； 所述核苷磷酸化酶酶液的接入量为所述反应底物质量的10 ‑12％； 转化温度为32℃， 转化pH为5.0， 转 化时间为20 h。 [0007]进一步的， 所述多聚磷酸盐为焦磷酸盐、 三聚磷酸盐或六偏磷酸盐中的任意一种 或几种的组合。 [0008]进一步的， 所述多聚磷酸盐为焦磷酸钠、 六偏磷酸钠和三聚磷酸钠， 且所述焦磷酸 钠、 所述六偏磷酸钠和所述 三聚磷酸钠的质量比为1： 1： 1。 [0009]进一步的， 所述核苷磷酸化酶酶液按如下步骤制备得到： (1)种子培养得到种子 液； (2)种子液接种至发酵培养基中发酵培养得到核苷磷酸化酶发酵液； (3)利用核苷磷酸说　明　书 1/7 页 3 CN 114958944 A 3