(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210686685.4 (22)申请日 2022.06.17 (71)申请人 南京农业大 学 地址 210095 江苏省南京市玄武区卫岗1号 (72)发明人 别小妹　马文杰　陆兆新　周立邦　 (74)专利代理 机构 南京天华专利代理有限责任 公司 32218 专利代理师 吴爽　徐冬涛 (51)Int.Cl. C12P 21/04(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12R 1/125(2006.01) (54)发明名称 一种通过脂肪酸代谢调控提高抗菌脂肽 bacillomycin D产量的方法 (57)摘要 本发明属于微生物学发酵领域， 具体涉及一 种 利 用 脂 肪 酸 代 谢 调 控 提 高 抗 菌 脂 肽 bacillomycin  D产量的方法： 以一株能够合成 bacillomycin  D的芽孢杆菌为出发菌株， 在发酵 起始时分别添加0.2 5~5 mmol/L的丙酸钠、 丙酸、 丁酸等3种脂肪酸或脂肪酸盐， 增加培养基中的 游离脂肪酸， 进而调控脂肪酸代谢途径， 增加活 性bacillomycin  D发酵产量。 本发明在基础培养 基中添加丙酸钠、 丙酸以 及丁酸 ， 均可使 bacillomycin  D产量显著提高， 分别可达到对照 组的1.44倍、 1.4倍和1.1倍； 丙酸钠的添加促进 bacillomycin  D合成基因的表 达， 从基因水平上 佐证了其对bacillomycin  D合成的促进作用。 同 时， 丙酸钠可 以引发部分信号因子表达上调， 这 些上调均可促进bacillomycin  D的合成。 此外， 丙酸钠还可促进部分脂肪酸代谢相关酶的表达 上调， 进而促进脂肪酸的代谢。 权利要求书1页 说明书8页 附图3页 CN 114854810 A 2022.08.05 CN 114854810 A 1. 一种通过脂肪酸代谢调控提 高bacillomycin  D发酵产量的方法， 其特征在于， 以能 够合成bacillomycin  D的芽孢杆菌为生产菌株， 在添加了脂肪酸和/或脂肪酸盐的基础发 酵培养基中发酵， 优选的， 所述脂肪酸为丙酸或丁酸， 所述脂肪酸盐为丙酸钠， 添加量在 0.25~5 mmol/L。 2.根据权利要求1所述的通过脂肪酸代谢调控提高bacillomycin  D发酵产量的方法， 其特征在于， 所述芽孢杆菌为 枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌 。 3.根据权利要求2所述的通过脂肪酸代谢调控提高bacillomycin  D发酵产量的方法， 其特征在于， 所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌 （ Bacillus  subtilis ） fmbJ， 由南京农业大学酶 工程实验室自主筛 选所得， 菌种保藏 号为CGMCC No.0943。 4.根据权利要求1所述的通过脂肪酸代谢调控提高bacillomycin  D发酵产量的方法， 其特征在于， 在发酵起始前， 向灭菌的发酵培养基中添加脂肪酸和/或脂肪酸盐， 添加终浓 度为0.25~5 mmol/L。 5.根据权利要求4所述的通过脂肪酸代谢调控提高bacillomycin  D发酵产量的方法， 其特征在于， 所述丙酸钠、 丙酸的最 适添加量在2.5  mmol/L。 6.根据权利要求4所述的通过脂肪酸代谢调控提高bacillomycin  D发酵产量的方法， 其特征在于， 所述 丁酸的最适添加量在0.25  mmol/L。 7.根据权利要求1 ‑6任一所述的通过脂肪酸代谢调控提高bacillomycin  D发酵产量的 方法， 其特征在于， 所述芽孢杆菌活化后接种到种子培养基， 再将种子液接入发酵培养基， 发酵条件为33 ℃， 180 rpm， 发酵时间为72 ‑120 h。 8.根据权利 要求7任一所述的通过脂肪酸代谢调控提 高bacillomycin  D发酵产量的方 法， 其特征在于， 具体包括如下步骤： （1） 菌种 活化： 将枯草芽孢杆菌在LA培养基上进行划线， 置于37  ℃恒温培养箱静置培 养12‑16 h， 挑单菌落于LB培 养基中， 37  ℃， 180 rpm过夜活化； （2） 种子培养： 将活化后的菌液接入种子培养基， 37  ℃， 180 rpm培养至 OD600达到0.8‑ 1.0； （3） 发酵培养： 用滤膜将脂肪酸过滤除菌， 加入灭菌的发酵培养基， 调整pH至7.0 ±0.2， 然后将种子液接种到各组发酵培 养基中， 3 3 ℃， 180 rpm发酵72‑120 h； （4） 产物检测： 将发酵液离心， 收集上清液； 调整上清液pH至2.0， 4  ℃静置过夜； 离心弃 上清， 收集沉淀， 重悬， 调整重悬液pH至7 .0， 超声处理50  min， 离心取上清获得 bacillomycin  D粗提液； 粗提液过直径0.22  μm的滤膜， 通过分析型高效液相色谱对粗提液 中的baci llomycin D进行定量检测， 即可。 9.权利要求1 ‑8任一所述的通过脂肪酸代谢调控提高bacillomycin  D发酵产量的方法 在bacillomycin D生产方面的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114854810 A 2一种通过脂肪酸代谢调控提高抗菌脂肽bacil lomycin D产量 的方法 技术领域 [0001]本发明属于微生物发酵领域。 具体涉及一种通过外源添加游离脂肪酸， 促进脂肪 酸代谢， 调控并提高抗菌 脂肽baci llomycin D产量的方法。 背景技术 [0002]芽胞杆菌生产的抗菌脂肽主要有surfactin、 iturin和fengycin三大家族， 其中 bacillomycin  D属于iturin家族， 是由一条含14 ‑17个C的脂肪酸链和一条7个氨基酸的肽 链缩合而成 的环状脂肽。 Bacillomycin  D作为一种天然的抗菌脂肽， 具有良好的抗真菌作 用， 尤其对黄曲霉的抑制效果十 分显著， 且与传统抗菌剂相比， 脂肽类物质具有广谱、 高效、 安全无毒、 易降解等特性， 因而在 食品化妆品、 医药、 农业等相关行业具有良好的应用前景。 但目前看来， bacillomycin  D产量普遍较低， 导致其生产成本高， 这也 成为了制约其大规模 生产和应用的关键问题。 [0003]抗菌脂肽作为一种次级代谢产物， 通过优化发酵条件， 可以达到提高产量或者改 变复合产物各组分比例的效果。 有关bacillomycin  D发酵培养基的优化， 已有的研究主要 集中在糖类、 氨基酸和微量元素等方面。 例如在发酵培养基中添加菊糖、 L ‑Gln等均可使 bacillomycin  D产量显著提高。 这主要是通过提供碳骨架、 肽链合成元件、 能量， 以及调节 部分与bacillomycin  D合成相关的信号因子的表达来实现的。 此外， bacillomycin  D的脂 肪酸链由PKS酶系 合成， 酰基 ‑CoA硫酯中间体和丙二酰CoA是其直接前体， 此二者与脂肪酸 代谢息息相关。 理论上， 在发酵培养基中添加游离脂肪酸可以促进菌体内的脂肪酸代谢。 但 考虑到bacillomycin  D合成机制的特殊性， 菌体初 级代谢中的脂肪酸合 成及代谢途径能否 影响bacillomycin  D的合成， 怎样影响bacillomycin  D的合成尚未可知。 通过向发酵培养 基中添加脂肪酸 来提高baci llomycin D产量方面的研究也是空白的。 发明内容 [0004]针对现有现有技术的不足， 本发明提供了一种通过脂肪酸代谢调控提高抗菌脂肽 bacillomycin  D产量的方法。 本发明通过 向发酵培养基中添加 丙酸钠、 丙酸、 丁酸， 分别使 bacillomycin  D的发酵产量提高为对照组的1.44倍、 1.4倍和1.1倍， 具有显著的提高 bacillomycin D的发酵产量的效果。 [0005]本发明具体技 术方案如下： [0006]一种通过脂肪酸代 谢调控提高抗菌脂肽bacillomycin  D产量的方法， 以能够合成 bacillomycin  D的枯草芽孢杆菌为生产菌株， 在添加了脂肪酸和/或脂肪酸盐的基础发酵 培养基中发酵， 所述脂肪酸为丙酸 或丁酸， 所述脂肪酸盐为丙酸钠， 添加量为0.25～5mmol/ L。 [0007]本发明首次发现添加特定浓度的丙酸、 丙酸钠和丁酸能够促进bacillomycin  D的 合成。 可能是由于上述脂肪酸(盐)更易转化为与bacillomycin  D的装配路径相关的物质。说　明　书 1/8 页 3 CN 114854810 A 3