(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210734895.6 (22)申请日 2022.06.27 (71)申请人 山东第一医科 大学 （山东省医学 科 学院） 地址 250117 山东省济南市槐荫区青岛路 6699号 (72)发明人 颜文秀　陈曦　辛璐璐　宗工理　 曹广祥　付加芳　张佩佩　刘士理　 (74)专利代理 机构 济南金迪知识产权代理有限 公司 37219 专利代理师 孙振家 (51)Int.Cl. C12P 19/62(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12R 1/465(2006.01) (54)发明名称 一种通过提前激活纳他霉素合成来提高纳 他霉素发酵产量的方法 (57)摘要 本发明涉及一种通过提前激活纳他霉素合 成来提高纳他霉素发酵产量的方法。 包括： 采用 低氮源发酵培养基进行纳他霉素发酵， 在发酵至 64～80h后， 按照培养基体积的8～12％补加含高 氮源母液， 继续发酵， 得到纳他霉素。 本发明先采 用低氮源发酵培养基进行纳他霉素的前中期发 酵， 然后再向低氮源发酵培养基中添加高氮源母 液， 依据纳他霉素合成阶段性的特点， 有效地提 高了纳他霉素的产量， 使 得摇瓶发酵产量最高为 2.95g/L。 采取扩大生产后， 在1L发酵体系中， 纳 他霉素产量为7.88g/L， 显著高于正常发酵生产 的6.03g/L， 纳他霉素产量 提高达到了20.73％。 权利要求书1页 说明书7页 附图2页 CN 114875100 A 2022.08.09 CN 114875100 A 1.一种通过提前激活纳他霉素合成来提高纳他霉素发酵产量的方法， 其特征在于， 包 括步骤如下： 采用低氮源发酵培养基进行纳他霉素发酵， 在发酵至64～80h后， 按照培养基体积的8 ～12％补加高氮源 母液， 继续发酵， 得到纳他霉素； 所述低氮源发酵培养基的成分为： 大豆蛋白胨1.5～2.5g/L， 酵母提取物0.4～0.5g/L， 氯化钠1.5～ 2.5g/L， 结晶硫酸镁0.5～1.5g/L， 葡萄糖3 0～50g/L； 所述高氮源母液为酵母提取物和大豆蛋白胨的混合物， 添加高氮源母液后酵母提取物 的终浓度为0.5～3g/L， 大豆蛋白胨的终浓度为2 ～10g/L。 2.如权利要求1所述的提高纳他霉素发酵产量的方法， 其特征在于， 所述低氮源发酵培 养基的成分为： 大豆蛋白胨2g/L， 酵母提取物0.45g/L， 氯化钠2g/L， 结晶硫酸镁1g/L， 葡萄 糖40g/L， pH为7.5 。 3.如权利要求1所述的提高纳他霉素发酵产量的方法， 其特征在于， 所述高氮源母液中 大豆蛋白胨的浓度为30～50g/L， 酵母提取物的浓度为5～10g/L； 添加高氮源母液后酵母提 取物的终浓度为2.25g/L， 大豆蛋白胨的终浓度为10g/L。 4.如权利要求1所述的提高纳他霉素发酵产量的方法， 其特征在于， 所述纳他霉素发酵 生产所用菌株为褐黄孢链霉菌(Streptomyces  gilvosporeus)、 纳塔尔链霉菌 (Streptomyces  natalensis)、 恰塔努加链霉菌(Streptomyces  chattanoo gensis)或利迪 链霉菌(St reptomyces  lydicus)。 5.如权利要求1所述的提高纳他霉素发酵产量的方法， 其特征在于， 在纳他霉素发酵生 产68h后补加高氮源 母液。 6.如权利要求1所述的提高纳他霉素发酵产量的方法， 其特征在于， 所述纳他霉素发酵 的总时间为10 0～150h。 7.如权利要求1所述的提高纳他霉素发酵产量的方法， 其特征在于， 所述纳他霉素发酵 的总时间为120 h。 8.如权利要求1所述的提高纳他霉素发酵产量的方法， 其特征在于， 具体包括步骤如 下： (1)配制低氮源发酵培 养基和高氮源 母液， 灭菌后备用； (2)无菌条件下， 取纳他霉素生产菌孢子涂布于琼脂斜面培养基 中活化， 然后将活化好 的孢子刮入种子 培养基中， 培 养， 得种子液； (3)将步骤(2)中的种子液按5％ 的接种量接入低氮源发酵培养基中， 发酵培养， 在发酵 64～80h后， 向培 养基中补加步骤(1)高氮源 母液， 继续发酵， 得纳他霉素。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114875100 A 2一种通过提前激活纳他霉素 合成来提高纳他霉素发酵产量的 方法 技术领域 [0001]本发明涉及 一种通过提前激活纳他霉素合成来提高纳他霉素发酵产量的方法， 属 于纳他霉素制备技 术领域。 背景技术 [0002]临床真菌感染和食品真菌污染是威胁人类健康的两大重要因素。 纳他霉素 (Natamycin)  (又称匹马霉素， Pimaricin)是一种具有还原性的多烯大环内酯类抗真菌剂， 其分子式为  C33H47NOl3， 分子量为665.75， 等电点为6.5。 纳他霉素是由内酯环缩合海藻氨基 糖行成， 其中26个碳原子组成的内酯环骨架结构中存在4个共扼双键形成的多烯发色团。 由 于其性质稳定、 口服毒性 非常低、 肠道无吸收、 无过敏反应、 无 交叉抗性等特点， 不仅在 食品 原料保鲜、 成品防腐方面具有较好的抗菌效果， 而且在医药、 青储饲料、 粮储、 家 禽养殖等方 面被广泛应用。 [0003]纳他霉素生物合成基因簇中存在一个胆固醇氧化酶基因(sgnE/pimE/scnE/ slnE)， 其编码的胆固醇氧化酶并不参与纳他霉素的母核、 侧链的合成及缩合反应。 但近年 来国内外研究证实， 胆固醇氧化酶在纳他霉素 的生物合成中必不可少， 胆固醇氧化酶参与 纳他霉素的合成与积累(Mendes  MV,et al.Cholesterol  oxidases  act as signaling   proteins  for the biosynthesis  of the polyene  macrolide  pimaricin.Chemistry   and Biology,2007,14:279 ‑290)。 进一步的相关研究说明， 发酵初期添加成品的胆固醇氧 化酶能够提 高纳他霉素的产 量(Wang M,et al..Improvement of  natamycin  production   by cholesterol  oxidase overexpression  in Streptomyces  gilvosporeus,  Journal  of Microbiology  and Biotechnology,2016,26(2):241 ‑247)。 中国专利文献公开了CN   113481266A一种利用纳他霉素发酵副产物之一的胆固醇氧化酶提高纳他霉素发酵产量的 方法， 包括胆固醇氧化酶制备和添加的步骤。 由该发明方法合成纳他霉素 的最高发酵单位 可达6.7g/L。 但是现有技 术中纳他霉素的产量 仍可进一 步提升。 [0004]此外， 纳他霉素作为一种次级代谢产物。 发酵微生物在一定的生长时期， 以初级代 谢产物为前体， 才能进 行生物合成， 因此纳他霉素等抗生素的发酵周期中， 存在一定时间的 生产延滞期， 此时期内抗生素不合成或者低速率合成。 因此如何克服这一问题是进一步提 高纳他霉素发酵产量的关键 。 发明内容 [0005]针对现有技术的不足， 本发明提供一种通过提前激活纳他霉素合成来提高纳他霉 素发酵产量的方法。 本发明人首次发现发酵初期， 低氮源含量的培养基(酵母提取物和大豆 蛋白胨)， 能够促进纳他霉素提前合成， 减短其延滞期； 发酵中后 期， 高氮源含量的培养基则 有利于纳他霉素 的积累。 利用此发酵特点， 本发明通过发酵初期和中前期降低氮源主要来 源的酵母粉和大豆蛋白胨 浓度、 发酵中后 期补加高氮源母液， 维持纳他霉素高效合成、 实现说　明　书 1/7 页 3 CN 114875100 A 3