(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210657039.5 (22)申请日 2022.06.10 (71)申请人 陕西师范大学 地址 710062 陕西省西安市长安 南路199号 (72)发明人 李治　刘芙巧　黄婧祎　李利君　 孙燕　 (74)专利代理 机构 西安永生专利代理有限责任 公司 61201 专利代理师 高雪霞 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12N 1/38(2006.01) C12R 1/425(2006.01) (54)发明名称 一种适合沙雷氏菌L-鼠李糖诱导表达系统 的应用培 养基和培养方法 (57)摘要 本发明公开了一种适合沙雷氏菌L ‑鼠李糖 诱导表达系统的应用培养基和培养方法， 所述应 用培养基是在基础培养基中加入NaOH蚀刻的6系 铝合金、 透性化学试剂和L ‑鼠李糖配制而成。 本 发明利用NaOH蚀刻的6系铝合金切割去除沙雷氏 菌表面的多糖糖被， 提高鼠李 糖扩散进细胞内的 效率； 透性化学试剂改善细胞被膜的通透性， 诱 导物鼠李 糖的细胞内扩散运输， 快速提高细胞内 的鼠李糖浓度， 诱导表达系统发挥功能。 而且本 发明结合双温变温 ‑重复循环培养法， 兼顾沙雷 氏菌中鼠李 糖诱导系统的有效性和高效性， 使鼠 李糖使用浓度从20g/L降低到了2～10g/L， 同时 缩短了诱导培养时间， 在沙雷氏菌鼠李糖诱导系 统广泛化和规模化生产应用方面具有能够降低 人力物力和资源消耗成本的潜力。 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 CN 114854645 A 2022.08.05 CN 114854645 A 1.一种适合沙雷氏菌L ‑鼠李糖诱导表达系统的应用培养基， 其特征在于： 所述应用培 养基是将液体基础培养基或固体基础培养基高温高压灭菌后自然放冷至60～70℃， 再加入 NaOH蚀刻的6系铝合金、 透性 化学试剂和L‑鼠李糖配制而成； 所述液体基础培养基每升含蛋白胨8～12g、 酵母粉0.5～1.5g、 氯化钠4～6g、 甘油8～ 12mL， 余量为超纯水， pH 6.8～7.2； 所述固体 基础培养基是在每升液体 基础培养基中加入琼脂粉15～ 20g获得； 所述透性 化学试剂由表面活性剂、 金属螯合剂、 有机溶剂组成。 2.根据权利要求1所述的适合沙雷氏菌L ‑鼠李糖诱导表达系统的应用培养基， 其特征 在于： 所述液体 基础培养基每升加入NaOH蚀刻的6系铝合金45～5 5g。 3.根据权利要求1或2所述的适合沙雷氏菌L ‑鼠李糖诱导表达系统的应用培养基， 其特 征在于所述NaOH蚀刻的6系铝合金的制备方法为： 将6系铝合金加洗涤剂去除油污， 再用超 纯水清洗去除洗涤剂， 随后用1～5mol/L的NaOH水溶液浸泡30～180分钟， 再用超纯水清洗 去除NaOH， 121℃灭菌15～ 20分钟。 4.根据权利要求3所述的适合沙雷氏菌L ‑鼠李糖诱导表达系统的应用培养基， 其特征 在于： 所述6系铝合金为 直径3～5m m的铝合金小球。 5.根据权利要求1所述的适合沙雷氏菌L ‑鼠李糖诱导表达系统的应用培养基， 其特征 在于： 所述表面活性剂为吐温、 Triton ‑X、 CTAB中任意一种或多种， 其加 入量为液体基础培 养基体积的1％～ 2％。 6.根据权利要求1所述的适合沙雷氏菌L ‑鼠李糖诱导表达系统的应用培养基， 其特征 在于： 所述金属螯合剂为EDTA ‑Na2、 EGTA‑Na4中任意一种或两种， 其在应用培养基中的终浓 度为1.5～5 μmo l/L。 7.根据权利要求1所述的适合沙雷氏菌L ‑鼠李糖诱导表达系统的应用培养基， 其特征 在于： 所述有机溶剂为甲醇、 乙醇、 氯仿中任意一种或多种， 其加入量为液体基础培养基体 积的1％～5％。 8.根据权利要求1所述的适合沙雷氏菌L ‑鼠李糖诱导表达系统的应用培养基， 其特征 在于： 所述液体 基础培养基每升加入L ‑鼠李糖2～10g。 9.根据权利要求1所述的适合沙雷氏菌L ‑鼠李糖诱导表达系统的应用培养基， 其特征 在于： 所述沙雷氏菌为Serratia  surfactantfaciens、 Serratia  marcescens、 Serratia   plymuthica、 Ser ratia liquefaciens、 Ser ratia rubidaea 中任意一种或多种。 10.一种沙雷氏菌L ‑鼠李糖诱导的培养方法， 其特征在于： 接种沙雷氏菌于权利要求1 所述的应用培养基中， 按28～30℃培养2～2.5小时， 接着35～37℃培养2～2.5小时为一个 循环， 连续进行3个 循环共培 养12～15小时。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114854645 A 2一种适合沙雷氏菌L ‑鼠李糖诱导表达系统的应用培养基和培 养方法 技术领域 [0001]本发明属于微生物技术邻域， 具体涉及一种沙雷氏菌的诱导型培养基和培养方 法。 背景技术 [0002]沙雷氏菌属肠杆菌目耶尔森氏菌科沙雷氏菌属， 是一类环境广泛分布的革兰氏阴 性细菌， 具有产生丰富代谢产 物的能力， 同时具有 条件致病性， 是引起医院内感染的主要病 原体之一。 近年来沙雷氏菌因为上述特性而成为研究热点。 现有的以大肠杆菌E.coli为模 式的研究技术虽然可以转用到沙雷氏菌研究中， 但是 由于沙雷氏菌具有其本身的独特性， 需要对这些研究技术进行改造升级。 其中在沙雷氏菌中可控的诱导基因表达技术具有重要 应用意义。 [0003]目前常用的革兰氏阴性细菌诱导型启动子有乳糖诱导启动子pLac、 阿拉伯糖诱导 型启动子par aB、 四环素诱导型启动子ptet和鼠李糖诱导启动子prhaB。 诱导物乳糖和阿拉 伯糖可被宿主细胞代谢利用， 难以保持稳定诱导浓度， 当细胞生长尤其是高密度细胞发酵 的情况下必需随后多次加入大量诱导物， 提高了生产成本， 此外这些化合物的代谢物其后 可能对培养物产生毒害作用。 人工诱导物异丙基 ‑β‑D‑硫代半乳糖苷(IPTG)和脱水四环素 (aTC)虽然不能被代谢并由此保证了长期诱导， 但是人工合成诱导物非常昂贵并在一些情 况下对生物体生长具有不利影响， 这使得 大规模到 工业规模的应用很不经济 。 [0004]在大肠杆菌中的鼠李糖诱导表达系统， L ‑鼠李糖通过转运蛋白(RhaT)摄取到细胞 中， 通过异构酶(RhaA)转换成L ‑鼠李酮糖(L ‑rhamnulose)， 然后L ‑鼠李酮糖进一步通过鼠 李酮糖1‑磷酸酶(RhaB)磷酸化并由醛缩酶( RhaD)水解产生磷酸二羟丙酮和乳醛。 基因 rhaBAD组成操纵子并在已知的rhaPBAD启动子辅助下转录。 鼠李糖系统与其他系统相比区 别在于调节需要两个激活因子RhaS和RhaR， 这两者组成转录单位并以与rhaBAD相反的方向 转录。 当L ‑鼠李糖存在时， RhaR结合rhaPRS启动子并起始其自身表达和RhaS的表达。 RhaS一 旦由L‑鼠李糖活化， 接下来作为效应物结合rhaPBAD启动子和rhaT基因的独立rhaPT启动子 并活化结构基因的转录。 两激活因子的联合造成rhaPBAD启动子异常严格的转录表达控制。 阿拉伯糖诱导型araB启动子和鼠李糖诱导型rhaPBAD启动子的比较表明后者受控于更加严 格的调节并在无诱 导物鼠李糖条件下真正表现出零表型。 [0005]虽然鼠李糖诱导表达系统在大肠杆菌中表 现优秀， 但是在沙雷氏菌中应用时却效 率不高。 分析成因为： 1)沙雷氏菌菌体表面通常包被着多糖， 由荚膜多糖和 脂多糖组成； 2) 绝大数沙雷氏菌缺乏L ‑鼠李糖通过转运蛋白RhaT(197株具有完整基因组序列的沙雷氏菌 中， 183株菌无rhaT基因)， 不能有效地摄取鼠李糖到细胞中发挥诱 导物作用。 [0006]通过文献查找以及生物信息学分析发现， 在197株具有完整基因组序列的沙雷氏 菌中， 183株菌无rhaT基因， 只有14株菌具有rhaT基因， 可能发挥协助扩散作用， 有利于鼠李 糖细胞内摄取。 其余无rhaT基因的沙雷氏菌将只能依靠鼠李糖的被动扩散摄取， 效率低下；说　明　书 1/5 页 3 CN 114854645 A 3