(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210650976.8 (22)申请日 2022.06.09 (71)申请人 上海大学 地址 200444 上海市宝山区上 大路99号 (72)发明人 李辉　王晨　史崇丽　李叶勇　 曾令军　彭怡　 (74)专利代理 机构 北京律谱知识产权代理有限 公司 11457 专利代理师 孟德洲 (51)Int.Cl. A01K 67/033(2006.01) C12N 1/20(2006.01) G01N 15/10(2006.01) (54)发明名称 一种计数秀丽隐杆线虫子宫内发育胚胎数 目的方法 (57)摘要 本发明涉及一种计数秀丽隐杆线虫子宫内 发育胚胎数目的方法。 该发明方法以秀丽隐杆线 虫作为模式生物， 设计了一整套实验流程检测计 数秀丽隐杆线虫子宫内的胚胎数目。 该发明方法 能够使线虫虫体透明， 并将孕虫体内不方便计数 的胚胎完全暴露出来， 从而便于在普通光学体视 显微镜下计数胚胎数目。 本发明方法适用于从L1 期开始暴露， 最终状态处于孕期的秀丽隐杆线 虫。 本发明方法可为利用秀丽隐杆线虫研究生殖 能力， 尤其是 以子宫内胚胎数目为指标的毒理、 药理研究提供易于观察、 快速简便、 准确可靠的 实验方法， 检测结果具有较高的准确性和可靠 性， 适合推广使用。 权利要求书2页 说明书6页 附图1页 CN 114794029 A 2022.07.29 CN 114794029 A 1.一种计数秀丽隐杆线虫子宫内发育胚胎数目的方法， 其特征在于： 具体包括以下步 骤： 步骤1、 制 备大肠杆菌菌液； 选用新鲜制 备的大肠杆菌E.coli  OP50作为秀丽隐杆线虫 食物， 根据用途将大肠杆菌分成两种， 一种用于涂布NGM培养基， 另一种在TPHP暴露时用于 每日喂食秀 丽隐杆线虫； 该步骤1中， NGM培养基配制方法为： 1L去离子水中加入3gNaCl， 17g琼脂， 2.5g蛋白胨， 0.111g CaCl2， 0.24g MgSO4， 搅拌溶解， 121℃灭菌25min； 灭菌结束后， 将培养基冷却至55 ‑ 60℃后加 入1mL胆固醇溶液， 25mL磷酸钾缓冲溶液， 搅拌混匀， 用蠕动泵分装15mL培养基到 7cm培养皿中， 待室温冷却凝固后为 NGM培养基； 其中， 胆固醇溶液用无水乙醇配制， 浓度为5mg/mL； 磷酸钾缓冲溶液配制方法为每 100mL超纯水中加入10.83g  KH2PO4， 4.7g K2HPO4， 搅拌溶解， 121℃灭菌25mi n； 步骤2、 大肠杆菌涂布； 用移液枪吸取适量用于涂布的大肠杆菌于NGM培养基表面， 随 后， 用灭菌后的涂布棒或试管底部将大肠杆菌在培养皿中央涂匀； 待大肠杆菌完全附着在 NGM培养基， 形成一层薄膜后， 将其倒置放入20℃避光 生化培养箱中备用； 步骤3、 秀丽隐杆线虫培养； 将适量秀丽隐杆线虫接种到带有大肠杆菌的NGM培养基表 面， 每日观察秀丽隐杆线虫 的生长状态， 若大肠杆菌被消 耗完毕， 及时更换培养基， 直至大 部分秀丽隐杆线虫处于 孕期状态； 步骤4、 秀丽隐杆线虫裂解； 将培养至孕期的秀丽隐杆线虫用K液从培养皿中冲洗至 1.5mL离心管中， 清洗3次， 离心去掉上清液； 在离心管中加入1mL裂解液， 剧烈涡旋1.5min； 随后， 再次离心弃掉上清， 加入裂解液， 剧烈涡旋至孕虫完全裂解、 虫卵完全暴露为止； 收集 虫卵， 清洗 3‑5遍， 去除残余裂解液； 步骤5、 秀丽隐杆线虫同期化； 将虫卵滴加到不含大肠杆菌的NGM培养基上20℃避光培 养16‑20h， 此时秀丽隐杆线虫处于L1时期， 用K液冲洗该时期的秀丽隐杆线虫至1.5mL离心 管中， 清洗 3次； 步骤6、 配制 暴露溶液； 准确称取0.1000g  TPHP固体， 用二 甲基亚砜溶解至10g/L， 随后 用二甲基亚砜再次将TPHP稀释成浓度为10、 100、 1000、 5000mg/L的TPHP溶液， 作为母液备 用； 二甲基亚砜作为空白对照组母液； 将母液进一步用K液稀释100倍， 再用K+溶液稀释100 倍， 最终得到TPHP浓度为0、 1、 10、 10 0、 500 μg/L的秀 丽隐杆线虫暴露溶 液； 步骤7、 秀丽隐杆线虫在TPHP溶液中暴露； 将准备好的TPHP暴露液加到无菌6孔板中， 每 孔加5mL； 随后将同期化后处于L1时期的秀丽隐杆线虫均匀加入6孔板， 每日喂食大肠杆菌 100 μg/L， 培 养72h； 步骤8、 秀丽隐杆线虫暴露阶段选择； TPHP暴露结束后， 将秀丽隐杆线虫转移到含有大 肠杆菌E.coli  OP50的NGM培养基中培养至孕期， 之后 再取出孕期秀丽隐杆线虫至1.5mL离 心管中， 用K 液清洗3次； 步骤9、 配制NaClO溶液； 采用有效含氯量为5.5 ‑6.5％的NaClO， 按照体积比NaClO： K液 ＝1:4的比例稀释成实验用NaClO溶 液备用； 步骤10、 秀丽隐杆线虫透明化处理； 将配置好的NaClO溶液加入无菌24孔板中， 每孔加 入1mL； 随后向每孔内加入10 ‑20条秀丽隐杆线虫， 室温静置5min后， 每隔2min观 察秀丽隐杆 线虫状态， 直至线虫 虫体呈现透明；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114794029 A 2步骤11、 秀丽隐杆线虫子宫内胚胎数目计数； 将含有透明化秀丽隐杆线虫的24孔板置 于光学体视 显微镜下， 计数每条秀 丽隐杆线虫暴露的胚胎数目并计数； 步骤12、 数据分析； 数据分析采用SPSS软件， 设置样本置信区间为95％， 计算不同处理 组线虫体内发育胚胎数目的组内平均值、 平均误差 。 2.根据权利要求1所述的计数秀丽隐杆线虫子宫内发育胚胎 数目的方法， 其特征在于： 该步骤1中： 第一种用于涂布NGM培养基的制备方法是将单克隆大肠杆菌接种于LB培养液中， 37℃、 150rpm避光培 养16‑20h； 第二种每日喂食秀丽隐杆线虫的大肠杆菌制备方法是将第一种大肠杆菌菌液 12000rpm离心10min， 此时大肠杆菌在离心管底部， 弃掉上清液， 并按照原有上清液： K液(v: v)＝1:1进行替换。 3.根据权利要求1所述的计数秀 丽隐杆线虫子宫内发育胚胎数目的方法， 其特 征在于： 该步骤1中， K液培养基配制方法为每1L超纯水中加入2.386gKCl， 2.98g  NaCl， 搅拌混 匀， 121℃灭菌25mi n； 该步骤1中， LB培养液配制方法为： 每1L超纯水中加入10g蛋白胨， 5g酵母粉， 5g  NaCl， 搅拌溶解， 121℃灭菌25mi n。 4.根据权利要求1所述的计数秀丽隐杆线虫子宫内发育胚胎 数目的方法， 其特征在于： 该步骤3中： 更换培养基的方法为： 将 培养基表 面原有的秀丽隐杆线 虫用K液冲洗至1.5 mL离 心管中， 清洗3次， 离心去掉上清液， 随后将底部的秀丽隐杆线虫滴加到新的带有大肠杆菌 的培养基中。 5.根据权利要求1所述的计数秀丽隐杆线虫子宫内发育胚胎 数目的方法， 其特征在于： 该步骤1中： 该步骤4中， 裂解液的配制方法为： 每10ml裂解液中加入2.5ml有效含氯量为 5.5‑6.5％的NaClO溶 液， 7.5ml  K液， 0.1g NaOH。 6.根据权利要求1所述的计数秀丽隐杆线虫子宫内发育胚胎 数目的方法， 其特征在于： 该步骤6中， K+溶液配制方法为， 每1L超纯水中加入2.386g  KCl， 2.98g  NaCl， 0.333g   CaCl2， 0.36g MgSO4， 搅拌混匀， 121℃灭菌20mi n， 冷却后加入1mL胆固醇溶 液， 现用现配。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114794029 A 3