(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210830151.4 (22)申请日 2022.07.15 (83)生物保 藏信息 CCTCC NO： M2015 535 2015.09.14 CCTCC NO： M2019 960 2019.12.0 5 (71)申请人 有研资源环境 技术研究院 （北京） 有 限公司 地址 101407 北京市怀柔区雁栖经济开发 区兴科东大街1 1号 (72)发明人 闫潇　刘兴宇　高博文　张明江　 王建雷　 (74)专利代理 机构 北京北新智诚知识产权代理 有限公司 1 1100 专利代理师 张晶(51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) B09C 1/10(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种解磷菌-硫酸盐还原菌联合原位修复铀 污染土壤的方法 (57)摘要 本发明提供一种解磷菌 ‑硫酸盐还原菌联合 原位修复铀污染土壤的方法， 该方法包括： (1)在 待修复铀污染土壤表层进行打孔， 然后 在孔中埋 下柱管， 向柱管中注入兼性厌氧微生物菌液， 所 述兼性厌氧微生物为硫酸 盐还原菌SRB‑4； (2)向 待修复铀污染土壤表层喷淋好氧微生物菌液， 所 述好氧微生物为解磷菌GRINML12； 然后每周向柱 中添加培养基， 向表层喷淋培养基溶液； 微生物 接种90天为一个周期， 进行解磷菌 ‑硫酸盐还原 菌联合原位修复铀污染土壤。 本发 明提供的方法 通过引入的两种功能性微生物， 将铀污染土壤区 域的表层好氧层和下层厌氧层同时的实施原位 修复治理， 具有 修复成本低、 绿色环保， 无二次污 染的特点。 权利要求书2页 说明书6页 附图3页 CN 115181702 A 2022.10.14 CN 115181702 A 1.一种解磷菌 ‑硫酸盐还原菌联合原位 修复铀污染土壤的方法， 包括如下步骤： (1)在待修复铀污染土壤表层打复数个孔， 所有孔呈 方格状分布， 孔与孔间距0.5m2； (2)在孔中埋设柱管， 向柱管中灌注 兼性厌氧微生物菌液， 所述兼性厌氧微生物菌液中 所含兼性厌氧微 生物为硫酸盐还原菌SRB ‑4； (3)向待修复铀污染土壤表层喷淋好氧微生物菌液， 所述好氧微生物菌液中所含好氧 微生物为解磷菌GRI NML12； (4)然后每周向柱管中补充一次兼性厌氧微生物菌液， 向土壤表层补充喷淋一次好氧 微生物菌液； 以90天为 一个修复周期进行解磷菌 ‑硫酸盐还原菌联合原位 修复铀污染土壤。 2.根据权利要求1所述的解磷菌 ‑硫酸盐还原菌联合原位修复铀污染土壤的方法， 其特 征在于， 所述步骤(1)中， 打孔深度为距离土壤表层1m或污染深度的1/2 ‑2/3处， 打孔直径大 于柱管公称外径 2‑3cm。 3.根据权利要求1所述的解磷菌 ‑硫酸盐还原菌联合原位修复铀污染土壤的方法， 其特 征在于， 步骤(1)中， 所述柱管为硬PVC管， 所述柱管的公称外径为25或50mm， 所述柱管长为 1.2m； 所述柱管的一端完全密封， 密封的一端深入至孔的底部， 另一端完全开口， 为接种菌 液入口； 所述柱管柱管 上每隔3‑8cm开1孔， 孔径为1cm； 所述管柱外表面包裹8层棉质纱布。 4.根据权利要求3所述的解磷菌 ‑硫酸盐还原菌联合原位修复铀污染土壤的方法， 其特 征在于， 所述柱管 上每隔5cm开1孔。 5.根据权利要求1所述的一种解磷菌 ‑硫酸盐还原菌联合原位修复铀污染土壤的方法， 其特征在于， 步骤(2)中兼性厌氧微生物菌液的制备方法为： 将硫酸盐还原菌SRB ‑4按照体 积比5‑10％接种到扩培培养基中， 培养温度20 ‑35℃， 培养时间为5 ‑10天， 至硫酸盐还原菌 SRB‑4数量达107cfu/ml以上， 得到硫酸盐还原菌SRB ‑4母液， 然后使用前将硫酸盐还原菌 SRB‑4母液按照体积百分比10％加入到扩培 培养基中进行稀释， 得到兼性厌氧微 生物菌液； 其中， 硫酸盐还原菌SRB ‑4的分类命名为： Uncultured  sulfate‑reducing  bacterium   SRB‑4， 保藏单位为： 中 国典型培养物保藏中心， 地址： 中 国武汉武汉大学， 保藏日期为： 2015 年9月14日， 保藏编号 为： CCTCC NO： M2015 535； 所述扩培培养基 的配制方法为： 按如下比例将乳酸钠1 ‑3mL， 硫酸铵1 ‑5g， 硫酸镁0.1 ‑ 0.5g， 磷酸氢二钾0.5 ‑0.8g， 磷酸二氢钾0.5 ‑0.8g和氯化钙0.1 ‑0.3g溶于1L蒸馏水中， 调整 pH为7.0‑7.2， 121℃灭菌15 ‑30min。 6.根据权利要求1所述的一种解磷菌 ‑硫酸盐还原菌联合原位修复铀污染土壤的方法， 其特征在于， 所述步骤(3)中好氧微生物菌液的培养方法为： 将解磷菌GRINML12按照体积比 5‑10％接种到解磷培养基中， 培养温度20 ‑35℃， 摇床转速为120 ‑180rpm/min， 培养 时间为 3‑5天， 至解磷菌GRINML12的OD600达0.5， 得到解磷菌GRINML12母液， 使用前将解磷菌 GRINML12母液按照体积百分比10％加入到解磷培 养基中进行稀释， 得到好氧微 生物菌液； 其中， 解磷菌GRINML12的分类命名为： 泛菌属(Pantoe a sp.)GRINML12， 保藏单位为： 中 国典型培养物保藏中心， 地址： 中国武汉武汉大学， 保藏日期为： 2019年12月5 日， 保藏编号 为： CCTCC NO： M2019 960； 该解磷培养基的配制方法为： 按如下比例将葡萄糖5 ‑10g， 氯化钠1 ‑3g， 硫酸铵1 ‑3g， 氯 化镁5‑8g， 磷酸三钙3 ‑8g和氯化钾1 ‑5g溶于1L蒸馏水中， 调 整pH为6.0 ‑7.0， 121℃灭菌15 ‑ 30min。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115181702 A 27.根据权利要求1所述的解磷菌 ‑硫酸盐还原菌联合原位修复铀污染土壤的方法， 其特 征在于， 步骤(2)中所述兼性厌氧微生物菌液注入柱管 的体积为每平方米待修复铀污染土 壤加入兼性厌氧微 生物菌液0.1 ‑0.5L。 8.根据权利要求1所述的解磷菌 ‑硫酸盐还原菌联合原位修复铀污染土壤的方法， 其特 征在于， 步骤(3)中所述好氧微生物菌液喷淋的体积为每平方米待修复铀污染土壤喷淋好 氧微生物菌液0.1 ‑0.5L。 9.根据权利要求1所述的解磷菌 ‑硫酸盐还原菌联合原位修复铀污染土壤的方法， 其特 征在于， 每周向柱管和污染土壤表层补加一次含碳氮源和磷源的培养基， 按照0.05 ‑0.30 吨/m2， 用以保证功能微 生物活性。 10.根据权利要求9所述的解磷菌 ‑硫酸盐还原菌联合原位修复铀污染土壤的方法， 其 特征在于， 所述含碳氮源和磷源的培养基含乳酸钠、 硫酸铵和磷酸三钙； 其中， 培养基中碳 源含量以乳酸钠计算为0.1 ‑0.5m/v％， 氮源含量以硫酸铵计算为0.1 ‑0.5m/v％， 磷源含量 以磷酸三钙计算 为0.5m/v％。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115181702 A 3