(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210750595.7 (22)申请日 2022.06.28 (83)生物保 藏信息 CCTCC NO:M2021 1638 2021.12.17 (71)申请人 广东海洋大学 地址 524000 广东省湛江市麻章区海大路1 号 (72)发明人 李昆太　彭帅英　章帅文　谭明辉　 张俊　 (74)专利代理 机构 南昌贤达专利代理事务所 (普通合伙) 36136 专利代理师 潘金凤 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12N 1/02(2006.01)C12N 9/48(2006.01) C12N 9/54(2006.01) C12P 13/24(2006.01) C12P 13/22(2006.01) C12P 13/08(2006.01) C12P 13/04(2006.01) C12R 1/07(2006.01) (54)发明名称 一种芽孢杆菌及其筛选方法和在高效降解 羽毛上的应用 (57)摘要 本发明公开了一种芽孢杆菌及其筛选方法 和在降解羽毛上的应用， 涉及家禽养殖业环境资 源应用领域， 从家禽养殖场的土壤中， 分离筛选 到一株对鸡羽毛降解率达90％以上的菌株JY ‑ 23， 该菌株为芽孢杆菌， 并命名为芽孢杆菌JY ‑23 (Bacillus  sp.JY‑23)， 现保藏于中国典型培养 物保藏中心(菌种保藏号为CCTCC  NO ： M  20211638)。 本发明的芽孢杆菌， 能够将完整的鸡 羽毛几乎降解， 且羽毛降解过程可有效释放脯氨 酸、 酪氨酸、 赖氨酸和甘氨酸等有较大利用价值 的游离氨基酸， 为实现废弃羽毛角蛋白的资源化 利用提供了基础， 同时也能改善因羽毛废弃物大 量累积及不当处 理而造成的环境污染问题。 权利要求书1页 说明书11页 序列表1页 附图4页 CN 114958690 A 2022.08.30 CN 114958690 A 1.一种芽孢杆菌， 其特征在于， 命名为芽孢杆菌JY ‑23(Bacillus  sp.JY‑23)， 于2021年 12月17日保藏于中国典型培 养物保藏中心， 保藏编号 为： CCTCC NO： M2021 1638。 2.如权利要求1所述的芽孢杆菌， 其特 征在于， 其基因序列如SEQ  ID NO.1所示。 3.一种如权利要求1所述的芽孢杆菌， 其特 征在于， 从家禽养殖场的土壤中筛 选得到。 4.一种芽孢杆菌的筛 选方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 步骤一： 采集含有芽孢杆菌的土壤； 步骤二： 分别配制 羽毛降解培 养基、 酪蛋白培 养基以及LB培 养基； 步骤三： 将步骤一所述的土壤加入无菌生理盐水中， 制得土壤悬液， 将土壤悬液加入到 羽毛降解培 养基中， 进行富 集培养； 步骤四： 取富集后的培养液， 加入无菌水进行逐级稀释， 分别吸取10‑4、 10‑5、 10‑6稀释液 200 μL涂布在酪蛋白培养基的平板上， 于恒温培养箱中培养； 观 察酪蛋白培养基平板上微生 物的生长情况及菌落形态， 初筛获得在酪蛋白培养基的平板上具有明显水解圈且有不同形 态的单菌落， 然后接种至LB培 养基试管斜面上培养和保藏； 步骤五： 将初筛的菌株斜面用无菌水洗出， 充分摇匀， 制备菌悬液； 吸取菌悬液加入到 装有40mL  LB培养基的250mL三角瓶中， 进行培养， 获得种子液； 按规定的接种量， 将种子液 接种在羽毛降解培养基中， 进行培养， 测定羽毛的降解率， 并根据各菌株的羽毛降解率大 小， 复筛获得羽毛高效降解菌株。 5.根据权利要求4所述的一种芽孢杆菌的筛选方法， 其特征在于， 所述羽毛降解培养基 包括： 鸡羽毛， K2HPO4， NaCl， MgSO4·7H2O， CaCl2， FeSO4·7H2O， 蒸馏水， pH  7.4‑7.6， 121℃湿 热灭菌。 6.根据权利要求4所述的一种芽孢杆菌的筛选方法， 其特征在于， 所述酪蛋白培养基包 括： 酪蛋白， 牛肉膏， NaCl， CaCl2， 琼脂， 蒸馏水， pH  7.2‑7.6， 121℃湿热灭菌 。 7.根据权利要求4所述的一种芽孢杆菌的筛选方法， 其特征在于， 所述Luria  broth (LB)培养基包括： 蛋白胨， 酵母 浸粉， 氯化钠， 蒸馏水， pH  7.0， 121℃灭菌 。 8.一种如权利要求1 ‑3任一所述的芽孢杆菌或4 ‑7任一所述的筛选方法得到的芽孢杆 菌在降解羽毛上 的应用， 其特征在于， 在所述芽孢杆菌在以羽毛为唯一碳氮源的羽毛降解 培养基下， 前36h能够分泌角蛋白酶， 致使羽 毛角蛋白中的二硫键发生断裂， ， 在第72h时羽 毛降解率至少为92％， 且羽毛降解过程有效释放脯氨 酸、 酪氨酸、 赖氨酸和甘氨酸的游离氨 基酸。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114958690 A 2一种芽孢杆菌及其筛选方 法和在高 效降解羽毛上的应用 技术领域 [0001]本发明涉及养殖业环境资源应用领域， 具体讲是一种芽孢杆菌及其筛选方法和在 高效降解羽毛上的应用。 背景技术 [0002]作为家禽养殖业的副产物， 全球每年大量产生的羽毛除一小部分被用于生产羽毛 产品及其副产品外， 大部分作为垃圾填埋或者焚烧， 给水、 土壤和空气造成极大的污染， 严 重破环生态环境。 角蛋白是羽毛的主要组成物质， 占到羽毛总质量的90％左右。 然而羽毛角 蛋白结构致密， 不溶于水和有机溶剂， 并存在大量相互交联的二硫键、 氢键和盐键等化学 键， 因此它对许多蛋白酶的蛋白水解具有极强的抵抗力， 在自然条件下很难降解。 [0003]目前， 羽毛的水解主要采用化学和物理方法处理。 虽然这些方法在羽毛降解方面 是可行的， 但它们能耗高且对环境有二次污染， 此外理化降解过程还会破坏一些必需氨基 酸， 包括色氨酸、 赖氨酸和蛋氨酸等， 显著影响了羽毛蛋白的利用价值。 角蛋白酶 (Keratinase， EC3.4.21/24/99.11)能够专一性降解角蛋白， 不仅绿色环保、 经济实用， 而且 不会破坏氨基酸的天然结构， 是一种理想的羽毛角蛋白降解方式。 角蛋白酶产生菌的来源 与分布十 分广泛， 在细菌、 放线菌和真菌中均发现有角蛋白酶的产生。 目前发现的角蛋白酶 大多产于细菌， 其中又以芽孢杆菌属(Bacillus  sp.)为主。 因此， 研究利用微生物角蛋白酶 这一绿色生物转化途径来处理羽毛废弃物， 将其转变为可利用的蛋白质资源， 不仅能缓解 我国蛋白质饲料资源短缺的现状， 而且也能改善当今由羽毛废弃物造成的环境污染问题， 具有重要的现实意 义和研究价 值。 发明内容 [0004]本发明的目的在于至少解决现有技术中存在的技术问题之一， 提供一种高效降解 羽毛的芽孢杆菌及其筛 选方法和应用。 [0005]本发明的技 术解决方案如下： [0006]一种芽孢杆菌， 其分类名称为Bacillus  sp.JY‑23， 于2021年12月17日保藏于中 国 典型培养物保藏中心， 保藏编号 为： CCTCC NO： M2021 1638。 [0007]优选地， 其基因序列如SEQ  ID NO.1所示。 [0008]优选地， 从家禽养殖场的土壤中筛 选得到。 [0009]本发明还公开了一种芽孢杆菌的筛 选方法， 包括以下步骤： [0010]步骤一： 采集含有芽孢杆菌的土壤； [0011]步骤二： 分别配制 羽毛降解培 养基、 酪蛋白培 养基以及Luria  broth(LB)培 养基； [0012]步骤三： 将步骤一所述的土壤加入无菌生理盐水中， 制得土壤悬液， 将土壤悬液加 入到羽毛降解培 养基中， 进行富 集培养； [0013]步骤四： 取富集后的培养液， 加入无菌水进行逐级稀释， 分别吸取10‑4、 10‑5、 10‑6稀 释液200 μL涂布在酪蛋白培养基的平板上， 于恒温培养箱中培养； 观 察酪蛋白培养基平板上说　明　书 1/11 页 3 CN 114958690 A 3