(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210917227.7 (22)申请日 2022.08.01 (71)申请人 厦门承葛生物科技有限公司 地址 361006 福建省厦门市 火炬高新区(翔 安)产业区翔星路88号台湾科技企业 育成中心W6 05A室 (72)发明人 张帮周　李源涛　林雄　袁文功　 何剑全　肖传兴　 (74)专利代理 机构 北京挺立专利事务所(普通 合伙) 11265 专利代理师 蔡宗慧 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12N 1/02(2006.01) (54)发明名称 一种肠道菌群的高通量分离培养与筛选方 法 (57)摘要 本发明是一种肠道菌群的高通量分离培养 与筛选方法， 包括以下步骤： 步骤1， 粪便样筛选 与预处理： 对获取的粪便样本进行16S扩增子测 序， 分析粪便样本的菌群丰富度； 步骤2， 活菌检 测： 利用活菌检测技术测定步骤1中的粪便样稀 释液中活菌总量； 步骤3， 极限稀释培养： 计算稀 释倍数， 将稀释后的混合细菌培养基转移到9 6细 菌培养板中进行培养； 步骤4， 转移培养： 挑选生 长孔数合适的9 6孔细菌培养板， 全部转移至新的 96孔中间板； 步骤5， 菌种鉴定： 提取上一骤中的 取出的菌液DNA， 电泳检测扩增条带并送样测序； 检查测序的峰图质量， 并进行序列比对； 步骤6， 菌种保藏。 权利要求书2页 说明书6页 附图4页 CN 115261271 A 2022.11.01 CN 115261271 A 1.一种肠道菌群的高通 量分离培养与筛选方法， 其特 征在于该 方法包括以下步骤： 步骤1， 粪便样筛选与预处理： 对获取的粪便样本进行16S扩增子测序， 分析粪便样本的 菌群丰富度； 步骤2， 活菌检测： 利用活菌检测技 术测定步骤1中的粪便样稀释液中活菌总量； 步骤3， 极限稀释培养： 根据活菌总量， 计算稀释倍数， 并使用改良培养基对步骤1所得 的粪便样进行梯度稀释， 将稀释后的混合细菌培养基转移到96细菌培养板中， 并使用封口 膜密封后， 放入37℃厌氧培 养箱进行培 养； 步骤4， 转移培养： 挑选生长孔数不超过40％的96孔细菌培养板， 全部转移至新的96孔 中间板， 再取出部分菌液用于菌液DNA的提取， 再向96孔中间板中补充YCFA、 BHIS或MRS富营 养培养基或定向筛 选培养基， 继续培 养剩余菌液； 步骤5， 菌种鉴定： 提取上一骤中的取出的菌液DNA， PCR扩增16S基因序列， 电泳检测扩 增条带并送样测序； 检查测序的峰图质量， 并进行序列比对； 步骤6， 菌种保藏： 比对所得菌种鉴定结果， 筛选需要保藏的菌株编号， 按照对应编号保 藏步骤4中所述的96孔中间板所培 养的菌液。 2.根据权利要求1所述的肠道菌群的高通量分离培养与筛选方法， 其特征在于步骤1 中， 将含有目的菌种且相对丰度较高的供体粪便样用于分离培养或定 向筛选， 并按照一定 比例往粪便样中加入改良的生理盐水， 震荡混匀； 所述的粪便样按1g： 10 0‑500 μl的比例向粪便样中加入改良的生理盐水进行震荡混匀。 3.根据权利要求2所述的肠道菌群的高通量分离培养与筛选方法， 其特征在于步骤1 中， 所述的生理盐水中可添加半胱氨酸盐酸盐、 维生素C、 维生素E、 茶多酚抗氧化剂中的一 种或任意组合。 4.根据权利要求1所述的肠道菌群的高通量分离培养与筛选方法， 其特征在于步骤3 中， 所述的改良培养基配方应为模拟肠道环境的培养基或定 向筛选培养基， 模拟肠道环境 培养基包括： YCFA、 BHIS、 Bryant  and Burkey培养基； 定向筛选培养基包括： 以黏蛋白为单 一碳源的Akkermansia  muciniphila筛选培养基、 促进Lactobacillus生长的M17肉汤或乳 酸杆菌选择性肉汤、 促进Bifidobacterium生长的B BL或TPY培养基。 5.根据权利要求4所述的肠道菌群的高通量分离培养与筛选方法， 其特征在于步骤3中 梯度稀释的准确性， 以1 ‑10倍的倍数进行梯度稀释至目标浓度， 使96孔细菌培养板中仅有 10‑30％孔数有菌生长 。 6.根据权利要求1所述的肠道菌群的高通量分离培养与筛选方法， 其特征在于步骤3中 所述的96孔细菌培养板应采用96深孔板进 行， 深孔板每孔体积应不小于400 μl， 每孔的加样 体积应不超过80％。 7.根据权利要求1所述的肠道菌群的高通量分离培养与筛选方法， 其特征在于步骤3中 所述的封口膜为塑封膜、 石蜡膜、 硅胶膜、 铝膜中的任意 一种。 8.根据权利要求1所述的肠道菌群的高通量分离培养与筛选方法， 其特征在于步骤4中 所述的96孔中间板的每孔体积应不小于1.6ml。 9.根据权利要求1所述的肠道菌群的高通量分离培养与筛选方法， 其特征在于步骤5 中， 所述菌液DNA的提取， 使用96孔磁珠法进行DNA提取， 或一步裂解法释放菌液DNA， 通过离 心收集上清后直接进行16S序列的扩增。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115261271 A 210.根据权利要求9所述的肠道菌群的高通量分离培养与筛选方法， 其特征在于步骤5 中， 步骤5的菌液DNA在进行PCR之前需调整至20 ‑100ng/ μl， 同时， 使用石英酶标板进行批量 检测。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115261271 A 3