(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210835426.3 (22)申请日 2022.07.15 (71)申请人 山东鼎创生物科技有限公司 地址 257092 山东省东营市农业高新 技术 产业示范区中心街19号 (72)发明人 岳国磊　徐兴锋　郝宁宁　 (74)专利代理 机构 北京天驰君泰律师事务所 11592 专利代理师 孟锐 (51)Int.Cl. C05G 1/00(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12R 1/065(2006.01) (54)发明名称 一种耐盐固氮固体 菌肥及其制备方法 (57)摘要 本发明涉及一种耐盐固氮固体菌肥及其制 备方法， 其解决了现有技术中固氮菌的发酵和剂 型常温难以保存的技术问题， 其包括如下步骤： (1)耐盐固氮菌的活化、 复壮； (2)耐盐固氮菌的 种子培养； (3)耐盐固氮菌的发酵生产； (4)耐盐 固氮菌固体菌肥的制备。 本发明可用于耐盐固氮 固体菌肥的制备。 权利要求书1页 说明书4页 附图5页 CN 115108863 A 2022.09.27 CN 115108863 A 1.一种耐盐固氮固体菌肥的制备 方法， 其特 征是， 包括如下步骤： (1)耐盐固氮菌 的活化、 复壮： 将耐盐固氮菌菌种接种于Ashby固体培养基， 培养,连续 传代2次后； 继续在改良无氮培 养基传代1次,培 养； (2)耐盐固氮菌的种子培养： 从改良无氮培养基挑取单菌落， 接种于Ashby培养基， 并于 带有玻璃珠的三角瓶， 进 行摇床培养， 转接种子培养基， 培养， 即得到一级种子培养液； 将一 级种子培养液转接 至发酵罐， 培养， 得到二级种子液； (3)耐盐固氮菌的发酵生产： 将一级种子培养液转接至发酵培养基发酵罐， 培养， 得到 耐盐固氮菌发酵 液； (4)耐盐固氮菌固体菌肥的制备： 将上述耐盐固氮菌发酵液与吸附剂混合， 充分搅拌均 匀， 浅层堆 放， 制得耐盐固氮菌固体菌肥。 2.根据权利要求1所述的耐盐固氮菌肥的制备方法， 其特征在于： 所述步骤(1)中的改 良无氮培养基配方： 甘露醇10g/L， 葡萄糖5g/L， KH2PO4 0.2g/L， MgSO4·7H2O 0.2g/L， NaCl   30.0g/L， CaSO4·2H2O 0.2g/L， CaCO3 5g/L。 3.根据权利要求1所述的耐盐固氮菌肥的制备方法， 其特征在于所述步骤(2)中的种子 培养基配方： 葡萄糖10～20g/L， KH2PO4 1.0g/L， MgSO4·7H2O 0.2g/L， CaCO3 0.5g/L， FeCl3  0.3g/L,NaMoO4·2H2O 0.4g/L。 4.根据权利要求1所述的耐盐固氮菌肥的制备方法， 其特征在于： 所述步骤(3)中的发 酵培养基配方为： 葡萄糖15～30g/L， 甘油1～5g/L， KH2PO4 1～2g/L， MgSO4·7H2O 0.2～ 0.4g/L， FeCl3 0.2～0.3g/L， NaMoO4·2H2O 0.1～0.5g/L， CaCO3 0.5～1.0g/L， CaSO4·2H2O  0.1～1g/L。 5.根据权利要求1所述的耐盐固氮菌肥的制备方法， 其特征在于： 所述步骤(4)中的吸 附剂配方重量份为： 褐煤粉70～80份， 米糠粉5～10份， 过磷酸钙5～10份， Ph7.3～7.5 。 6.根据权利要求1所述的耐盐固氮菌肥的制备方法， 其特征在于： 所述步骤(3)中发酵 罐发酵参数控制温度为28℃ ±2℃； 前16h， 发酵罐搅拌速度为180rpm～200rpm， 通气量控制 0.5v/v·m； 16h后,发酵罐搅拌速度为200rp m～220rpm， 通气量控制1.0v/v ·m； 培养30h～ 40h。 7.按照权利要求1～6任一所述方法制得的耐盐固氮菌肥。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115108863 A 2一种耐盐固氮固体 菌肥及其制备方 法 技术领域 [0001]本发明涉及一种菌肥及其制 备方法， 具体地说， 涉及一种耐盐固氮固体菌肥及其 制备方法。 背景技术 [0002]自然界中存在一些微生物能将空气中的氮气还原为氨， 为微生物和植物提供氮 源， 这种现象被称为生物固氮。 固氮菌每年从空气中约固定1.5亿吨氮肥， 是全世界生产氮 肥总量的几倍。 据估算， 非共生生物固氮提供了作物氮素总量2 4％的氮素来源。 接种非共生 固氮菌是提高土壤生物固氮 能力， 从而降低氮肥施用量的最可行方案之一。 固氮菌的发酵 和常温保存， 一直是行业的难题， 导致商品中活菌数低， 制约了是固氮菌类菌剂的应用和推 广。 耐盐固氮菌作为农业生产用细菌类的一个新菌种， 马鸣超等认为耐盐固氮菌普遍存在 于土壤环 境中， 未见致病性报道， 属于风险一级(马鸣超， 姜昕， 曹凤明， 李俊。 生物有机肥生 产菌种安全分析及管控对 策研究[J].农产品质量与安全， 2019(6):57 ‑61.)， 因此耐盐碱的 耐盐固氮菌的开发和应用具有重要意义。 能在盐渍化的土壤中生存的固氮菌， 具备了在盐 碱地上的应用潜力。 [0003]目前固氮菌的发酵和剂型常温保存问题是行业的一个难点， 特别是耐盐固氮菌的 发酵和生产报道相对较少。 发明内容 [0004]本发明就是为了解决现有技术中固氮菌的发酵和剂型常温难以保存的技术问题， 提供一种可以常温保存 且活菌数较多的耐盐固氮固体菌肥及其制备 方法。 [0005]为此， 本发明提供一种耐盐固氮固体菌肥的制备方法， 其包括如下步骤： (1)耐盐 固氮菌的活化、 复壮： 将耐盐固氮菌菌种从 ‑80℃冰箱取出， 接种Ashby固体培养基， 30℃培 养48h,连续传代2次后； 继续在改良无氮培养基传代1次,30℃培养48h； (2)耐盐固氮菌的种 子培养： 从改良无氮培养基挑取单菌落， 接种于装 液量为200mL液体Ashby培养基， 并带有20 颗玻璃珠的500mL三角瓶， 进行摇床培养， 200rpm,28℃培养32～48h； 转接种子培养基， 200rpm,28℃培养48h， 即得到一级种 子培养液； 将一级种子培养液转接至装液量100L发酵 罐， 28℃培养32h， 得到二级种子液； (3)耐盐固氮菌的发酵生产： 将一级种子培养液转接至 发酵培养基装 液量1吨发酵罐， 控制温度为28℃ ±2℃； 培养30h～ 40h， 结合残糖剩余量和活 菌计数， 判定发酵的终止； (4)耐盐固氮菌固体菌肥的制备： 将上述耐盐固氮菌发酵液与吸 附剂按1:5的比例混合， 充分搅拌均匀， 混合后含水率控制30％～35％； 25℃浅层堆放， 保藏 通风， 适当抛翻， 3～5天后80～10 0目过筛， 制得耐盐固氮菌固体菌肥。 [0006]优选的， 所述步骤(1)中改良无氮培养基配方： 甘露醇10g/L， 葡萄糖5g/L， KH2PO4  0.2g/L， MgSO4·7H2O 0.2g/L， NaCl  30.0g/L， CaSO4·2H2O 0.2g/L， CaCO3 5g/L。 [0007]优选的， 所述步骤(2)中种子培养基配方： 葡萄糖10～20g/L， KH2PO4 1.0g/L， MgSO4·7H2O 0.2g/L， CaCO3 0.5g/L， F eCl3 0.3g/L,NaMoO4·2H2O 0.4g/L。说　明　书 1/4 页 3 CN 115108863 A 3