(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210968535.2 (22)申请日 2022.08.12 (71)申请人 中国农业科 学院北京畜牧兽医研究 所 地址 100193 北京市海淀区 圆明园西路2号 (72)发明人 沈青春　蒋卉　丁家波　范学政　 鑫婷　张广智　秦彤　汤新明　 梁瑞英　梁琳　李松励　 (74)专利代理 机构 成都宏田知识产权代理事务 所(普通合伙) 51337 专利代理师 常利敏 (51)Int.Cl. G01N 33/68(2006.01) G01N 33/569(2006.01) G01N 33/531(2006.01)C12N 1/20(2006.01) C12R 1/35(2006.01) (54)发明名称 一种羊支原体肺炎平板凝集抗原及其制备 方法与应用 (57)摘要 本发明公开了一种羊支原体肺炎平板凝集 抗原及其制备方法与应用。 其中羊支原体肺炎平 板凝集抗原使用丝状支原体山羊亚种SZ013株、 山羊支原 体山羊亚种SY006株和绵羊肺炎支原 体 MY018株制成， 其中3种支原体菌体的灭活前浓度 均为7.0×1010CCU/mL。 本申请提供的羊支原体 肺炎平板凝集抗原， 相比当前的羊支原体病检测 试剂产品， 具有检测范围较广的特点， 能同时检 测3种支原体感染， 而且使用简单、 直观， 普通饲 养员， 按照说明书即可使用， 并进行结果判定。 对 于养殖企业和农户来讲， 只需立 即确定羊群是否 有支原体感染即可， 无需确定由何种支原体感 染。 权利要求书1页 说明书6页 附图1页 CN 115097146 A 2022.09.23 CN 115097146 A 1.一种羊支原体肺炎平板凝集抗原， 其特征在于， 使用丝状支原体山羊亚种SZ013株、 山羊支原体山羊亚种SY006株和绵羊肺炎支原体MY018株制成， 其中3种支原体菌体的灭活 前浓度均为7.0 ×1010CCU/mL。 2.一种权利要求1所述的羊支原体肺炎平板凝集抗原的制备方法， 其特征在于， 包括以 下步骤： (1)将丝状支原体山羊亚种SZ013株、 山羊支原体山羊亚种SY006株和绵羊肺炎支原体 MY018株分别接种于羊支 原体培养基， 传代后制成3种基础种子 菌液； (2)将3种基础种子液分别接种于羊支 原体培养基中扩大培 养， 获得3种生产种子液； (3)将3种生产种子液分别进行发酵培 养， 并对菌液进行C CU计数和无菌检验； (4)在3种发酵培养菌液中分别加入含硫柳汞的PBS重悬灭活， 按CCU计数结果调整菌液 浓度， 将3种重悬后的菌液按体积比1:1:1混合， 加入结晶紫溶液染色和甘油制备得到羊支 原体肺炎平板 凝集抗原， 混匀后分装保存。 3.根据权利要求2所述的羊支原体肺炎平板凝集抗原的制备方法， 其特征在于， 具体包 括以下步骤： (1)基础种子液的制备： 取丝状支原体山羊亚种SZ013株、 山羊支原体山羊亚种SY006株 和绵羊肺炎支原体MY018株冻干菌种， 开启后， 分别按10％的量接种羊支原体培养基， 置37 ℃培养18～36h收获后作为一级基础种子， 将一级种子液按10％比例再接种传代1次， 收获 分装后置 ‑80℃冻存， 作为 二级基础种子； (2)生产种子液的制备： 取丝状支原体山羊亚种SZ013株、 山羊支原体山羊亚种SY006株 和绵羊肺炎支原体MY018株的二级基础种子， 按10％比例分别接种于生产用羊支原体培养 基， 置37℃恒温摇床， 120rpm震荡培养18～36h至培养基变为黄色， 扩 大培养， 获得生产种子 液； (3)发酵培养： 采用生物反应器分别大规模培养丝状支原体山羊亚种SZ013株、 山羊支 原体山羊亚种SY006株和绵羊肺炎支原体MY018株， 先对生物反应器进行灭菌， 无菌加入羊 支原体培养基， 按1:10的比例接种生产种子液， 37℃恒温培养， 严格控制不通气， 待pH下降 至6.9～7.0时， 添加羊支原体培养基为原培养体积的20％， 进 行两次补料培养， 待第二次培 养pH下降到 6.7～6.8时收获菌液， 并对菌液进行C CU计数和无菌检验； (4)抗原制备， 在3种菌液中分别加入0.2～0.4％羟甲基 纤维素钠， 置2～8℃静置7～10 日， 8000rpm离心菌液20min， 取沉淀用含0.01％硫柳汞的PBS重悬， 按照CCU计数结果， 调整 菌液浓度 为2.3×1011CCU/mL， 置37℃灭活3小时， 将3种重悬后的菌液按体积比1:1:1混合， 反复搅拌均匀后， 加入3％结晶紫溶液至终浓度为0.03％， 继续搅拌20分钟， 加入10％菌液 体积的甘油， 继续搅拌10分钟， 即得到羊支 原体肺炎平板 凝集抗原， 分装后置2 ～8℃保存。 4.权利要求1所述的羊支 原体肺炎平板 凝集抗原在羊支 原体肺炎感染检测中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115097146 A 2一种羊支原体肺炎平板凝集抗原及其制备方 法与应用 技术领域 [0001]本发明属于兽医诊断技术领域， 具体涉及 一种羊支原体肺炎平板凝集抗原及 其制 备方法与应用。 背景技术 [0002]羊支原体肺炎， 又称羊传染性胸膜肺炎， 是由支原体引起的一种高度接触性传染 病， 临床上表现为高热、 咳嗽胸腔浆液性和纤维素性炎症， 传 入性强， 急性病例表现为肺炎， 死亡率高， 慢性病例主要表现为关机炎、 乳房炎、 腹膜炎等。 该病在世界范围内广泛存在， 我 国主要养羊省份均存在该病， 特别是内蒙古、 青海、 新疆、 山东等养羊规模较大、 密度较高的 省份。 我国最早于1935年内蒙古就有类似该病的记录， 1942年～1943年在甘肃报告过羊传 染性胸膜肺炎的流行， 其后直到 当前， 在内蒙、 东北、 华北等地也出现过该病， 其 发病率在10 ～90％， 死亡率通常在0.85～60％， 最高可达100％。 该病给我国养羊业造成巨大的经济损 失， 严重影响养羊业的长期健康发展。 [0003]引起羊支原体肺炎 的病原种类较多， 主要包括丝状支原体山羊亚种、 山羊支原体 山羊亚种和绵羊肺炎支原体3种病原， 也有学者认为丝状支原体丝状亚种也能感染引山羊 起肺炎， 但病例不常见。 其中丝状支原体山羊亚种 可感染山羊和绵羊， 3岁以下山羊最为易 感； 山羊支原体山羊亚种只 感染山羊， 绵羊不易感； 绵羊肺炎支原体可感染山羊和绵羊。 感 染羊是最主要的传染源， 传播途径主要通过接触传播和空气传播， 引起绵羊支原体肺炎可 以由一种支原体感染引起， 也可以由2种或3种支原体混合感染所致。 当前我国获得批准的 羊支原体病检测试剂产品有绵羊肺炎支原体ELISA抗体检测试剂盒、 山羊传染性胸膜肺炎 间接血凝试验抗原与阴阳性血清、 绵羊支原体肺炎间接血凝试验抗原与阴阳性血清和山 羊 支原体山羊肺炎亚种抗体检测试纸条4种产品， 但中国兽药信息网的国家基础数据库 (http://vdts.ivdc.org.cn:8081/cx/)显示， 以上产品批准至今， 均无生产和批签发记录， 由此可判断当前我国批准生产的羊支原体检测试剂均没有进 行实际生产和销售， 分析其原 因可能是产品与实际需求存在差距， 无法满足当前生产需要。 当前能引起羊支原体肺炎的 主要有3个支原体种类， 而获得批准的4个产品均只能检测其中的1种， 容易引起误判， 而且 丝状支原体山羊亚种感染没有相应的检测试剂。 因此， 缺 乏一种能一次检测多种羊支原体 感染的试剂， 如果能简单 快速、 可视化， 则更能符合现场检测的市场需求。 发明内容 [0004]针对现有技术中的上述不足， 本发明提供一种羊支原体肺炎平板凝集抗原及 其制 备方法与应用。 选用丝状支原体山羊亚种SZ013株、 山羊支原体山羊亚种SY006株和绵羊肺 炎支原体MY018株研制开发的羊支原体肺炎平板凝集抗原及其对照血清， 用于羊血清中羊 支原体抗体的快速检测， 有助于解决我国当前羊支 原体感染检测 和防控中的问题。 [0005]为了达到上述发明目的， 本发明采用的技 术方案为： [0006]提供一种羊支原体肺炎平板凝集抗原， 其使用丝状支原体山羊亚种SZ0 13株、 山羊说　明　书 1/6 页 3 CN 115097146 A 3