(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210621355.7 (22)申请日 2022.06.01 (83)生物保 藏信息 CGMCC NO. 246 57 2022.04.08 (71)申请人 中国林业科 学研究院森林生态 环境 与自然保护研究所 地址 100089 北京市海淀区东小 府2号 (72)发明人 理永霞　李东振　孙宁宁　王璇　 温晓健　张星耀　 (74)专利代理 机构 北京集智东方知识产权代理 有限公司 1 1578 专利代理师 王鹏 (51)Int.Cl. C12N 1/02(2006.01) C12N 1/20(2006.01)A01N 63/20(2020.01) A01P 5/00(2006.01) C12R 1/43(2006.01) (54)发明名称 一种粘质沙雷氏菌的制备方法和应用 (57)摘要 本发明适用于微生物 技术领域， 提供了一种 粘质沙雷氏菌的制备方法， 方法包括： 采集马尾 松枝条和树干样品； 将样品剪成样品块， 并将样 品块消毒； 用无菌枝剪将样品块接触处理液表面 去除， 再将样品块剪成组织块； 将组织块置于离 心管中， 并在摇床中震荡； 取上清液涂布于牛肉 膏蛋白胨固体培养基， 置于培养箱黑暗培养； 挑 取红色单斑放入 牛肉膏蛋白胨液体培养基中， 置 于摇床下培养， 获得分离得到的菌株； 采集自浙 江省马尾松木质部， 具有显著的杀线虫能力， 且 对松树内微生态环境具有较好的适应性， 对松材 线虫病的发生具有抑制作用； 该菌株不会对环境 产生不良影 响， 且菌株活性稳定， 生产成本低， 生 产过程简单， 适用于松材线虫病防控的推广应 用。 权利要求书1页 说明书6页 附图5页 CN 115449484 A 2022.12.09 CN 115449484 A 1.一种粘质沙雷氏菌的制备 方法， 其特 征在于： 所述方法包括： S1， 采集浙江省杭州市马尾松枝条和树干样品； S2， 将所述马尾松枝条和所述树干样品剪成样品块， 并将所述样品块放入工作台内消 毒； S3， 用无菌枝剪将所述样品块接触处 理液表面去除， 再将 样品块剪成组织 块； S4， 将所述组织 块置于无菌水中的离心管中， 并在28℃、 20 0rpm/min的摇床中震荡3 h； S5， 取100μL上清液涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基(NA)， 置于28℃培养箱黑暗培养 24h； S6， 挑取红色单斑放入牛肉膏蛋白胨液体培养基(NB)中， 置于28℃， 200rpm/min的摇床 下培养24h， 获得分离得到的菌株。 2.如权利要求1所述的粘质沙雷氏菌的制备 方法， 其特 征在于： 将所述样品块 放入工作台 内消毒包括： 用0.5％次氯酸钠溶 液对所述样品块表面消毒6 0s， 用无菌水清洗 3次； 再用75％酒精处 理30s。 3.如权利要求2所述的粘质沙雷氏菌的制备 方法， 其特 征在于： 将这些所述样品块 放入工作台 内消毒还 包括： 所述无菌水清洗 3次后， 用无菌吸水纸吸干所述样品块表面水分。 4.如权利要求1所述的粘质沙雷氏菌的制备 方法， 其特 征在于： 所述样品块的大小为5 ×5×3cm； 所述组织 块的大小为5 ×5×1cm。 5.如权利要求1所述的粘质沙雷氏菌的制备 方法， 其特 征在于： 步骤S4过程中， 所述无菌水为10mL。 6.如权利要求1所述的粘质沙雷氏菌的制备 方法， 其特 征在于： 所述上清液的制备 方法， 包括： 按照1％的接种量将细菌种子液接种到灭菌后的NB培养基中， 置于28℃， 200rpm/min的 条件下分别培 养0.5、 1、 2、 3、 4、 5、 6天； 用血球计数板统计菌液浓度； 用无菌水菌液稀释至1 ×107CFU/mL备用； 12000rpm/min离心10min， 取上清用0.22 μm的微孔滤膜过滤两次， 除去菌体， 分别稀释2 倍、 5倍、 10倍、 10 0倍备用。 7.一种如权利要求1所述的粘质沙雷氏菌的应用， 其特 征在于： 所述粘质沙雷氏菌用于杀线虫活性和松树定殖能力。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115449484 A 2一种粘质沙雷氏菌的制备方 法和应用 技术领域 [0001]本发明属于微 生物技术领域， 尤其涉及一种粘质沙雷氏菌的制备 方法和应用。 背景技术 [0002]松材线虫(B ursaphelenchus  xylophilus)是国际重大检疫性有害生物， 在松属植 物体内寄生危害， 由其引起的松材线虫病会导致松林大面积死亡， 严重威胁我国生态环境 安全。 松材线 虫在致病过程中， 与 松树内生微生物发生着密切的相互作用， 其中存在 多种微 生物可以抑制松材线 虫种群的繁殖。 这些分离自松 树体内的微生物， 具有环境适应性 强、 生 物安全性高和对病害持续控制的特点， 已成为松材线虫病新型防控技 术的研究热点。 [0003]已报道的能够毒杀松材线虫的细菌主要包括粘质沙雷氏菌  (Serratia   marcescens)、 苏云金芽孢杆菌(Bacillus  thuringiensis)、 枯草芽孢杆菌(Bacillus   subtilis)等。 其中粘质沙雷氏菌分布广泛， 是常见的植物内生细菌， 具有广泛的环境适应 性， 通过人工接种， 可以成功定殖于南瓜、 西葫芦、 番茄、 水稻等植物体内， 主要存在于细胞 间隙， 茎部导管及通气组织内。 粘质沙雷氏菌主要分泌丝氨酸类水解蛋白， 作用于线虫体 壁， 最终导致线虫分解。 此外， 粘质沙雷氏菌还可以分泌灵菌红素等次级代谢产物， 对线虫 具有毒杀作用。 因此， 粘质沙雷氏菌在松材线虫病的防控中具有巨大的应用潜力， 然而目前 尚没有从松树体内分离鉴定 到可用的菌株资源。 发明内容 [0004]本发明提供一种粘质沙雷氏菌的制备方法和应用， 旨在 解决目前尚没有 从松树体 内分离鉴定 到可用的菌株资源的问题。 [0005]本发明是这样实现的， 一种粘质沙雷氏菌的制备方法， 所述方法包括： S1， 采集浙 江省杭州市马尾松枝 条和树干样品； S2， 将所述马尾松枝 条和所述树干样品剪成样品块， 并 将所述样品块放入工作台内消毒； S 3， 用无菌枝剪将所述样品块接触处理液表 面去除， 再将 样品块剪成组织块； S4， 将所述组织块置于无菌水中的离心管中， 并在  28℃、 200rpm/min的 摇床中震荡3h； S5， 取100 μL上清液涂布于牛肉膏 蛋白胨固体培养基(NA)， 置于28℃培养箱 黑暗培养24h； S6， 挑取红色单斑放入 牛肉膏蛋白胨液体培养基(NB)中， 置于28℃，  200rpm/ min的摇床下培 养24h， 获得分离得到的菌株。 [0006]优选的， 将所述样品块放入工作台内消毒包括； 用0.5％次氯酸钠溶液对所述样品 块表面消毒6 0s， 用无菌水清洗 3次； 再用75％酒精处 理30s。 [0007]优选的， 将这些所述样品块放入工作台内消毒还包括： 所述无菌水清洗3次后， 用 无菌吸水纸吸干所述样品块表面水分。 [0008]优选的， 所述样品块的大小为5 ×5×3cm； 所述组织 块的大小为  5×5×1cm。 [0009]优选的， 步骤S4过程中， 所述无菌水为10mL。 [0010]优选的， 所述上清液的制 备方法， 包括： 按照1％的接种量将细菌种子液接种到灭 菌后的NB培养基中， 置于28℃， 200rp m/min的条件下分别 培养0.5、 1、 2、 3、 4、 5、 6天； 用血球说　明　书 1/6 页 3 CN 115449484 A 3