(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210890208.X (22)申请日 2022.07.27 (71)申请人 广东博溪生物科技有限公司 地址 523808 广东省东莞 市松山湖高新 技 术产业开发区台湾高科技园桃园路1 号莞台生物技 术合作中心1栋1楼08室 (72)发明人 屈咪　卢永波　李潇　杨文娟　 (51)Int.Cl. C12N 5/071(2010.01) C12N 1/20(2006.01) C12Q 1/02(2006.01) G01N 33/68(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种类痤疮表型的体外重组表皮模型及构 建方法 (57)摘要 本发明涉及一种类痤疮表型的体外重组表 皮模型的构建方法， 所述构建方法包括以下步 骤： 步骤(1)： 表皮细胞的准备； 步骤(2)： 表皮细 胞的液下培养； 步骤(3)： 体外重组表皮模型的构 建； 步骤(4)： 将痤疮丙酸杆菌定植于体外重组表 皮模型。 本发 明提供的类痤疮体外重组表皮模型 的构建方法， 兼并了体外抑菌作用和细胞抗炎作 用两种检测模 型基础上， 还可通过形态学直观表 征“过度角化 ”现象。 此外， 体外检测的方式容易 实现标准化和稳定化， 可以避免种属差异和个体 差异， 同时提高检测效率。 权利要求书1页 说明书9页 附图3页 CN 115322951 A 2022.11.11 CN 115322951 A 1.一种类痤疮表型的体外 重组表皮模型的构建方法， 所述构建方法包括以下步骤： 步骤(1)： 表皮细胞的准备； 取原代角质形成细胞， 复苏扩增后， 使用P3～P7代细胞， 用消化液消化， 制成单细胞悬 液， 按照1.0 ×105～5×105个/mL的细胞密度， 接种于 培养瓶中培 养； 步骤(2)： 表皮细胞的液 下培养； 取步骤(1)得到的对数生长期的表皮细胞， 用细胞培养 液Ⅰ制成细胞密度为1.25 ×106～ 2.5×106个/mL的表 皮细胞悬浮液， 取适量接种到含有聚碳酸酯滤膜的细胞培养小室中， 培 养0.3～2小时； 然后将细胞培养小室置于培养皿内， 每只培养皿添加细胞培养液 Ⅰ， 继续培 养1～3天； 步骤(3)： 体外 重组表皮模型的构建； 将所述步骤(2)中的细胞培养小室内的培养液弃掉， 将培养皿内的培养液更换为细胞 培养液Ⅱ， 向培养皿内添加细胞培养液 Ⅱ使液面与细胞培养小室内细胞上表面位于同一水 平线， 进行气液面培 养， 培养时间为5～ 9天； 步骤(4)： 将痤疮丙酸杆菌 定植于体外 重组表皮模型； 将痤疮丙酸杆菌以2.0 ×107～2.0×109个/mL密度接种于步骤(3)获得的体外重组表皮 模型表面， 继续进行气液面培 养24‑72小时。 2.权利要求1所述的构建方法， 其中所述消化液为浓度2.0％ ‑3.0％的胰酶消化液。 3.权利要求1所述的构建方法， 其中所述 步骤(1)中用M CDB153培养基制成单细胞 悬液。 4.权利要求1所述的构 建方法， 其中所述细胞培养液 Ⅰ是以MCDB153为基础培养基， 添加 胰岛素0.5～5 μg/mL， 异丙肾上腺素0.1～1 μM， 氢化可的松0.02～ 0.2 μg/mL， 表皮生长因子1 ～10ng/mL， 腺嘌呤10～ 50 μg/mL， 转铁蛋白5～12 μg/mL， L ‑肉碱0.001～ 0.1mM和氯化钙0.03 ～0.2mM配制的。 5.权利要求1所述的构建方法， 其中所述细胞培养液 Ⅱ是以MCDB153为基础培养基， 添 加胰岛素0.5～ 5 μg/mL， 异丙肾上腺素0.1～1 μM， 表皮生长因子1～10ng/mL， 腺嘌呤10～50 μ g/mL， 转铁蛋白5～12 μg/mL， L ‑肉碱0.001～0.1mM， L ‑丝氨酸0.01～0.1mM， 棕榈酸0.01～ 0.05mM， 油酸0.01～0.05mM， 精氨琥珀酸0.05～ 0.1mM， 氯化钙1.0～1.5mM， 角质细胞生长因 子1～10ng/mL和粒细胞集 落刺激因子10～ 20ng/mL配制的。 6.权利要求1所述的构 建方法， 其中所述步骤(3)中气液面培养的培养时间为6 ‑8天； 优 选地， 培养时间为6天。 7.权利要 求1所述的构建方法， 其中所述步骤(4)中将痤疮丙酸杆菌以2.0 ×108个/mL密 度接种于步骤(3)获得的体外 重组表皮模型表面。 8.权利要求1所述的构建方法， 其中所述 步骤(4)中继续进行气液面培 养48小时。 9.一种类痤疮表型的体外重组表皮模型， 其特征在于， 所述模型通过权利要求1 ‑8任一 项所述的构建方法构建而成。 10.一种化妆品祛痘功效的评估方法， 其特征在于， 所述方法使用权利要求9所述的体 外重组表皮模型实现。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115322951 A 2一种类痤疮表型的体外重组表皮模型及构建 方法 技术领域 [0001]本发明属于 组织工程技术领域， 更具体涉及一种类痤疮表型的体外重 组表皮模型 的构建方法； 还涉及通过该方法构建的类痤疮表型的体外重组表皮模型以及使用该模型的 化妆品祛痘功效的评估方法。 背景技术 [0002]痤疮(Acne)是侵犯毛囊皮脂腺单元的一种疾病， 主要见于青春期人群， 好发于皮 脂腺丰富部位， 如： 面、 胸及 背部， 临床上主要表现为囊肿、 粉刺、 丘疹、 结节、 脓疱及瘢痕等。 部分患者在痊愈后其皮损部位会有 瘢痕遗留， 对面部美观影响较大。 有关调查表明， 在12～ 30岁人群中约有80％有过不同程度的痤疮。 [0003]在正常的代谢过程中， 毛囊皮脂腺导管上皮细胞脱屑， 皮脂腺分泌 皮脂， 皮脂腺携 带脱屑从毛囊口排除， 其中毛囊 可以寄生大量的皮肤正常菌群， 例如痤疮丙酸杆菌、 需氧葡 萄球菌等。 不正常的因素导致的性激素紊乱和皮脂腺痤疮丙酸杆菌的大量繁殖、 皮脂腺导 管的异常角化、 皮脂的大量分泌导 致了痤疮的产生。 [0004]痤疮的发病原因包括毛囊角化过度、 皮脂腺紊乱、 皮肤表面微生物过度生长和急 慢性炎症。 其中痤疮丙酸杆菌与以上因素的产生高度相关。 (1)痤疮通常以微粉刺开始， 由 漏斗部过度角化产生， 其大小和颗粒层数增加。 角质细胞过度增 生会引起皮脂腺导管上皮 细胞层不断增厚、 管径变小、 通畅度减弱， 最终导致毛囊皮脂腺导管急性闭塞， 毛囊隆起而 形成粉刺。 微粉刺演变成开放 或封闭的粉刺。 而角化过度的诱 发因素则包括雄激素、 IL ‑1和 皮脂成分的改变[1]。 (2)当毛囊通道被痤疮丙酸杆菌定植， 通过t oll样受体发展和刺激细胞 因子产生， 导致炎症性病变。 炎症因子中IL ‑1的产生会加剧漏斗部的过度角化， 而IL ‑8是一 种中性粒细胞趋化因子， 可将中性粒细胞吸引到滤泡壁中。 一旦毛囊壁破裂， 就会产生皮下 硬结、 瘢痕和瘢痕疙瘩的肉芽肿性病变[2]。 (3)在痤疮形成的过程中， 雄激素导致皮脂腺紊 乱造成油脂分泌异常， 过度的油脂分泌为痤疮丙酸杆菌提供厌氧环境和营养物质， 痤疮丙 酸杆菌通过水解甘油三酯为甘油和游离脂肪酸， 而这些脂质代谢物会加剧炎症和过度角化 的反应。 [0005]根据以上机制， 目前针对痤疮的产品主要集中在控油、 抑菌、 剥脱角质和抗炎四个 方面。 大量宣称 “祛痘”功效的产品属于化妆品类， 根据2015年发布的 《化妆品监督管理条 例》 修订草案送审稿中[3]， 明确提出 “化妆品的功效宣称应当有充分的科学依据。 并且2021 年 《化妆品功效宣称 评价规范》 的公告[4]， 明确指出对 “祛痘”类产品宣称需要 人体功效评价 试验。 但是， 由于直接进行临床实验由于实验周期及安全性等问题的限制， 实现比较困难， 因此在进行临床试验之前， 需要设计合理的实验模型进行初步效果实验。 由于痤疮发病机 制的复杂性， 目前国内外对 “治疗痤疮 ”的原料和产品筛选主要是通过单一因素进行实验： (1)痤疮丙酸杆菌的体外抑菌实验； (2)基于 皮脂腺细胞的控油实验； (3)基于角质形成细胞 或免疫细胞的抗炎实验； (4)基于角质形成细胞的过度增殖实验。 现有的实验模 型检测体系 通常是以细胞为模型， 检测的是痤疮的单一性因素， 无法进 行综合性评判， 并且通过细胞作说　明　书 1/9 页 3 CN 115322951 A 3