(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221094786 0.0 (22)申请日 2022.08.05 (71)申请人 河南理工大 学 地址 454000 河南省焦作市高新区世纪大 道2001号 (72)发明人 刘建民　陈林勇　任恒星　宋燕莉　 郭鑫　赵娜　季长江　魏国琴　 (74)专利代理 机构 太原晋科知识产权代理事务 所(特殊普通 合伙) 14110 专利代理师 翟冲燕 (51)Int.Cl. B09B 3/60(2022.01) B09C 1/10(2006.01) C12N 1/14(2006.01) C12N 1/20(2006.01)G01N 21/31(2006.01) G01N 21/64(2006.01) G01N 27/626(2021.01) C12R 1/645(2006.01) C12R 1/07(2006.01) (54)发明名称 一种真菌细菌联合降解低阶煤的方法及其 降解率检测方法和降解液环境 安全性评价方法 (57)摘要 本发明属煤的微生物 转化技术领域， 提供一 种真菌细菌联合降解低阶煤的方法及其降解率 检测方法和降解液环境安全性评价方法。 真菌为 雅致小克银汉霉F 11， 细菌为芽孢杆菌属B1； 真菌 细菌联合的具体方法为： F 11接种入PDA固体培养 基， 30℃恒温倒置培养5d， 菌丝铺满培养基表面 后备用； B1接种入LB固体培养基， 30℃恒温倒置 培养2d， 菌落铺满平板后备用； 在已灭菌的LB液 体培养基中转接入已经培养好的F 11和B1， 30℃、 150rpm下恒温振荡培养4d， 然后加入灭菌的硝酸 氧化煤， 30℃、 150rpm下 继续培养， 待吸光度A450 稳定后即可。 根据降解液中重金属的含量判定降 解效果， 重金属含量越高则降解 率越高。 权利要求书1页 说明书14页 附图8页 CN 115430694 A 2022.12.06 CN 115430694 A 1.一种真菌细菌联合降解低阶煤的方法， 其特征在于： 所述真菌为雅致小克银汉霉 （Cunninghamellaelegans ） F11， 细菌为芽孢杆菌属 （Bacillus  sp. ） B1； 真菌细菌联合的具 体方法为： F11接种入PDA固体培养基， 30℃恒温倒置培养5d， 菌丝铺满培养基表面后备用； B1接种入LB固体培养基， 30℃恒温倒置培养2d， 菌落铺 满平板后备用； 在已灭菌的LB液体培 养基中转接入已经培养好的F11和B 1， 30℃、 150rpm下恒温振荡培养4d， 然后加 入灭菌的硝 酸氧化煤， 3 0℃、 150rpm下继续培 养， 待吸光度A45 0稳定后即可。 2.根据权利要求1所述的一种真菌细菌联合降解低阶煤的方法， 其特征在于： 打孔器接 入F11与B1的比例为： 3孔F1 1： 1孔B1、 2孔F1 1： 2孔B1、 1孔F1 1： 3孔B1或5 0孔F11： 1孔B1。 3.根据权利要求1所述的一种真菌细菌联合降解低阶煤的方法， 其特征在于： 所述硝酸 氧化煤为： 低阶煤破碎筛分至80目 ‑120目， 80℃烘干48h； 100g破碎筛分的煤样中加 入体积 比为1： 1的硝酸水溶液150mL， 室温水中进行反应， 同时不断搅拌至黄烟消失后静置反应 24h， 用纯 水清洗煤至上清液pH>6后将煤样在80℃下烘干72h 。 4.一种煤的生物降解检测方法， 利用权利要求1 ‑3任一所述真菌细菌联合降解低阶煤 的方法进 行煤的生物降解， 其特征在于： 分光光度计测量降解液在450nm处的吸光度 A450判 定煤的降解所 处阶段； A 450值稳定后， 将 煤的微生物降解液离心处理， 取上清液测定其中的 重金属Cr、 As、 Pb含量， 通过重金属含量的高低判定 煤的生物降解。 5.根据权利要求4所述的一种煤的生物降解检测方法， 其特征在于： 测定重金属含量具 体为： 待菌液A450值稳定后， 将共培养发酵液10000rpm下离心10min， 收集上清液， 按照 《水 质65种元素的测定电感耦合等离子体质谱法》 （HJ  700‑2014） 测上清液中Cr、 As、 Pb的含量； 利用降解液重金属Cr、 As、 Pb的含量指标判定降解 率的相对大小。 6.根据权利要求5所述的一种煤的生物降解率的检测方法， 其特征在于： 所述重金属含 量的测定方法为原子荧 光法或电感耦合 等离子体质谱法ICP ‑MS种的任意 一种。 7.一种真菌细菌联合降解低阶煤的降解液环境安全性评价方法， 所述降解液为权利要 求1‑3任一所述真菌细菌联合降解低阶煤的方法所得降解液， 降解液中重金属含量测定方 法为权利要求4中所述煤的生物降解率的检测方法， 其特征在于： 将 煤降解液中Cr、 As、 Pb的 含量与吸光度进行相关性分析， 线性拟合， 水污染情况评价采用单 因子评价， 结合煤降解液 中重金属的实测浓度， 计算出重金属的污染指数， 进 而做出环境 安全性评价。 8.根据权利要求7所述的真菌细菌联合降解低阶煤的降解液环境安全性评价方法， 其 特征在于： 水污染情况评价采用单因子评价， 以关注项目实际浓度除以相应的标准限值得 到污染指数， 当污染指数I≤1时， 表明该因子含量未超标， 当I＞1时说明该指标含量超标， 计算公式如下： ； 式中， Ci为i指标实测浓度； Si为i指标标准限值； Ii为污染指数。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115430694 A 2一种真菌细菌联合降解低阶煤的方 法及其降解率检测方 法和 降解液环境安全性评价 方法 技术领域 [0001]本发明属于煤的微生物转化技术领域， 具体涉及 一种真菌细菌联合降解低阶煤的 方法及其降解 率检测方法和降解液环境 安全性评价方法。 背景技术 [0002]我国有高达55亿亩 的退化土壤亟待修复， 在化肥减量化的背景下， 腐殖酸成为一 种公认的绿色高效的土壤改良剂， 风化煤和褐煤是目前生产腐殖酸的主要原料。 煤可以在 好氧微生物的作用下发生降解， 研究表明煤的好氧微生物降解的主要产物是腐殖酸， 相比 于需要用到强酸强碱的化学提取法， 生物法具有绿色温和等优点。 [0003]我国煤层气资源丰富， 埋深2000m以浅煤层气地质资源量约26万亿立方米。 煤可以 在厌氧微生物的作用下产气， 其基本原理是厌氧微生物利用煤中的部分有机质产生甲烷， 从而增产煤层气， 将煤转化为低碳清洁能源。 为了促进煤的降解提高生物气产率， 国内外学 者尝试了各种 预处理方法， 如微生物预处理、 外加电场 强化、 过氧化氢氧化预处理、 超临界 二氧化碳萃取、 氢氧化钠预处理、 硝酸氧化预处理等。 微生物预处理中常用的白腐真菌、 假 单胞菌等同时也是煤的好氧微 生物降解中常见的菌种。 [0004]重金属指的是原子量>55 的金属。 重金属可污染环境并通过食物链在人体中富集 从而危害人体健康。 我国各省区煤中均还有重金属， 由重金属 导致的煤系含水层的健康风 险大于其他含水层、 煤矸石山堆放过程中释放一定量的重金属进入土壤、 煤散烧过程中造 成大气的重金属污染。 煤炭加工利用过程中重金属的转化排放等问题需要格外关注。 细菌 与真菌对 金属元素的吸附作用， 微生物对煤矸石中的铁、 锰、 镉的释放的促进作用等均 表明 煤降解过程中重金属的变化需要引起注意。 [0005]综上所述， 研究煤 的微生物降解可促进煤 的清洁低碳利用， 对于实现 “双碳”目标 具有重要意义， 尤其是煤的好氧微生物降解， 既可以作为煤的微生物气化的预 处理步骤， 也 可以作为独立的工艺产生土壤改良剂等产品。 研究煤的微生物降解过程中重金属含量的变 化， 进行环境污染评价及人体健康评价， 对于掌握技术应用过程中可能产生的环境影响具 有一定意 义。 [0006]现有研究表面， 可降解煤的微生物包括： 细菌如： 芽孢杆菌属如多粘类芽孢杆菌 （Paenibacilluspolymyxa ） 、 巨大芽孢杆菌( Bacillus  megaterium )、 短小芽孢杆菌 (Bacillus  pumilus )、 枯草芽孢杆菌( Bacillus  subtilis )、 蜡状芽孢杆菌( Bacillus   cereus)、 苏云金芽孢杆菌( Bacillus  thuringien sis)等， 链霉菌属 （ Streptomyces） 如浅黄 链霉菌(Streptomyces  flaveolus)、 沙阿霉素链霉菌( Streptomyces  zoamyceticu )、 绿孢 链霉菌(Streptomyces  vridosporus )、 黄微绿链霉菌( Streptomyces  flavovirens )、 西唐 氏链霉菌(Streptomyces setonii)、 栗褐链 霉菌(Streptomyces badius)等， 假单胞菌属如 恶臭假单胞菌( Pseudomonos  putida)、 球红假单胞菌( Rhodopseudomon as spheroids )、 绿 脓杆菌（ Pseudomonas  aeruginosa ）等以及葡萄球菌属的金黄色葡萄球菌说　明　书 1/14 页 3 CN 115430694 A 3