(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210620708.1 (22)申请日 2022.06.02 (83)生物保 藏信息 CCTCC NO: M 202 2060 2022.01.11 (71)申请人 华中农业大 学 地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山 街1号 (72)发明人 周东海　符杨　杨小琦　张嘉宾　 高蓉　王飞帆　张梦迪　 (74)专利代理 机构 重庆信必达知识产权代理有 限公司 5 0286 专利代理师 陈小东 (51)Int.Cl. C12P 3/00(2006.01) C12N 1/20(2006.01)A61K 33/04(2006.01) A61P 9/00(2006.01) G01N 21/31(2006.01) C12R 1/085(2006.01) C12R 1/125(2006.01) (54)发明名称 一种用于抑制心肌肥大的生物源纳米硒的 制备方法及药物 (57)摘要 本发明属于纳米硒制备技术领域， 公开了一 种用于抑制心肌肥大的生物源纳米硒的制备方 法及药物， 选 择牦牛源、 马源的益生菌并纯化； 将 纯化后的益生菌接种至含亚硒酸钠的LB肉汤中， 摇床培养； 筛选亚硒酸钠还原率高、 发酵液红色 物质生成量多的菌株； 将筛选的还原率高的菌株 接种至LB肉汤中进行常规培养； 将筛选的还原率 较高的菌株在含亚硒酸钠的LB琼脂平板上划线 培养， 挑取红色单菌落， 得到验证并筛选出最佳 菌株蜡样芽孢杆菌A 3； 设置含亚硒酸钠的LB肉汤 中硒含量浓度梯度以及培养时间梯度， 选择得到 最高耐受浓度以及最优培养时间， 提取纳米硒 球， 进行表征及纯度测定。 本发明的纳米硒有蛋 白包被， 粒径小， 纯度高， 稳定性更好。 权利要求书2页 说明书5页 附图1页 CN 114921500 A 2022.08.19 CN 114921500 A 1.一种用于抑制心肌肥大的生物源纳米硒的制备方法及药物， 其特征在于， 所述用于 抑制心肌肥大的生物源纳米硒的菌株筛选及制备方法包括： 从已有菌株中选出亚硒酸钠还 原率最佳的一株， 并筛选出其最佳培养浓度和时间， 采用该筛选菌株和筛选条件利用微生 物还原法进行纳米硒的制备。 2.如权利要求1所述用于抑制心肌肥大的生物源纳米硒的菌株筛选方法， 其特征在于， 所述用于抑制心肌肥 大的生物源纳米硒的菌株筛 选方法包括以下步骤： 步骤一， 选择6株来自牦牛源、 马源的益生菌， 并对选择的6株益生菌进行纯化； 将纯化 后的益生菌按1％的接种量接种至含有3、 6、 12、 18、 24、 30mmol/L硒元素的LB肉汤中常规培 养； 步骤二， 根据细菌发酵液的颜色， 试管底部的红色沉淀多少， 以及DAB法测量得到的亚 硒酸钠还原率筛 选出最佳菌株； 步骤三， 将筛选的菌株在含3、 6、 12、 18、 24、 30mmol/L亚硒酸钠的LB琼脂平板上划线培 养， 挑取红色单菌落， 重复3次液体发酵、 琼脂平板划线， 验证菌株； 步骤四， 将选出的菌株按1％的比例接种至含有18、 20、 22.5、 24mmol/L亚硒酸钠的LB肉 汤中进行浓度筛选。 选出最适浓度后， 将菌株按1％的比例接种至含有最适浓度亚硒酸钠的 LB肉汤中培 养12、 24、 48、 72、 96、 120 h进行时间筛 选。 3.如权利要求1所述用于抑制心肌肥大的生物源纳米硒的制备方法， 其特征在于， 所述 用于抑制心肌肥 大的生物源纳米硒的制备 方法包括以下步骤： 步骤一， 将筛选出的菌株在LB肉汤中摇床培养至OD600为0.7时按1％的比例接种至含 亚硒酸钠最佳浓度的LB肉汤中， 在37℃， 180r/mi n的条件下培 养最适时间； 步骤二， 将培养好的菌液在 4℃， 13000r/min离心10min， 弃去上清； 将沉淀用0.9％NaCl 清洗三次， 每次在12000r/min离心8min； 清洗后将沉淀置于无菌研钵中， 加 入液氮研磨； 研 磨后用少量无菌水重悬， 然后在冰浴、 功率为100W的条件下超声处理10min， 在4℃、 12000r/ min离心10min并收集沉淀物； 用含1 ％SDS的1.5mol/L  Tris‑HCl(pH 8.3)离心洗涤沉淀物3 次， 最后用无菌水洗涤3次； 步骤三， 用无菌水重悬沉淀物， 按V重悬液∶V正辛醇＝2： 1的比例加入正辛醇。 充分混匀 后， 4℃， 20 00g离心5mi n， 分离混合相， 并在4℃下储 存24h； 步骤四， 经过24h后， 将液体弃去， 留沉淀； 然后重复步骤三， 直至混合相中间没有细菌 碎片； 然后弃去液体， 沉淀用无菌水 换管清洗5次， 无菌水重悬， 静置10分钟后吸取 液体； 步骤五， 纳米硒颗粒的制备： 将在4℃静置24小时后的上下相弃去， 留沉淀； 然后分别用 氯仿、 75％乙醇清洗一次； 然后用无菌水重悬沉淀， 进行冷冻干燥48h以上， 得到纳米硒颗 粒； 步骤六， 对纳米硒进行表征和Na2S法检测纯度。 4.如权利要求2所述用于抑制心肌肥大的生物源纳米硒的菌株筛选方法， 其特征在于， 所述4株来自牦牛源、 2株来 自马源的益生菌包括： 蜡样芽孢杆菌A1、 蜡样芽孢杆菌A2、 蜡样 芽孢杆菌A3、 枯 草芽孢杆菌 E1、 枯草芽孢杆菌4.3、 枯 草芽孢杆菌9.3 。 5.如权利要求2所述用于抑制心肌肥大的生物源纳米硒的菌株筛选方法， 其特征在于， 步骤一中， 所述纯化包括： 将已有的6株菌在LB肉汤培养基中常规培养， 然后在LB琼脂平板 上划线培 养， 挑取单菌落， 重复液体发酵、 琼脂平板划线， 3次后提取细菌DNA进行测序鉴定 。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114921500 A 26.如权利要求2所述用于抑制心肌肥大的生物源纳米硒的菌株筛选方法， 其特征在于， 步骤一中， 所述摇床培 养包括： 37℃、 180r/mi n的摇床中培 养120h。 7.如权利要求2所述用于抑制心肌肥大的生物源纳米硒的菌株筛选方法， 其特征在于， 所述接种包括： 将6株益生菌分别接种于亚硒酸钠浓度为3、 6、 12、 18、 24、 30mmol/L的LB肉汤 中， 并设置三个重复； 步骤一中， 所述常规培 养包括： 37℃、 180r/mi n的摇床中常规培 养120h； 所述筛选DAB法测量的亚硒酸钠还原率最 高的菌株包括： 准备含1g/L  Se的亚硒酸钠标 准液， 将标准液用超纯水稀释成0、 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18、 2 0mg/L的溶液， 体积均为1ml， 然后再加超纯水至4 ml； 用现配的1： 1浓盐酸将pH调至2～ 3， 再加入400 μL  0.2mol/L的EATA ‑ 2Na溶液和 200 μL 0.5％DAB溶液。 将样品混匀后 放入60℃温箱内20min， 而后用10％NaOH溶 液将pH调至7～7.5； 在试管内准确加入1ml甲苯， 剧烈摇晃混匀； 在3000r/min离心5min， 吸 取有机层于420nm处测量 吸光度， 以吸光度为y轴， 硒浓度为x轴绘制标准曲线； 将培养好的 菌液在13000r/min离心10min后， 吸取上层澄清发酵液10 μL， 100倍稀释至1ml后 补足超纯水 至4ml， 然后按 上述标曲测定步骤进 行； 用此标准曲线 可以测算出培养液内剩余亚硒酸钠的 含量， 从而计算出菌株对于亚硒酸钠的还原率。 8.如权利要求3所述用于抑制心肌肥大的生物源纳米硒的制备方法， 其特征在于， 所述 筛选出的菌株、 最佳浓度和最适培养时间包括： 筛选出的菌株为蜡样芽胞杆菌A3， 最佳浓度 为20mmol/L， 最适培养时间为96 h； 所述表征方法包括： 扫 描电镜分析、 透射电镜分析、 紫外可见光光谱测定、 zeta电势、 光 动态散射分析、 傅里叶红外光谱分析、 ED S能谱分析； 所述Na2S检测纯度方法包括： Se 标曲的测定 配制0.01mo l/LNa2SeO3 1mol/LNa2S 取11支10mL离心管分别加入0、 100、 200、 300、 400、 500、 600、 700、 800、 900、 1000μL的 0.01mol/LNa2SeO3， 加入25μmol盐酸羟胺(NH3OHCl)， 盐酸羟胺过量保证反应完全， 反应 30min， N2流下干燥， 加入1ml  1mol/L Na2S溶液， 反应1小时； 500nm处测定OD值， 建立 标曲； 称 取制备的纳米硒0.0007g， 加入1ml  1mol/L Na2S溶液， 反应1小时， 500nm处测定OD值， 代入 标曲进行计算。 9.一种利用如权利要求1 ‑8任意一项所述用于抑制心肌肥大的生物源纳米硒的制备方 法制备的生物源纳米硒。 10.一种如权利要求9所述用于抑制心肌肥大的生物源纳米硒作为用于抑制心肌肥大 的药物的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114921500 A 3