(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211027539.7 (22)申请日 2022.08.25 (71)申请人 武汉诺越基因生物科技有限公司 地址 430000 湖北省武汉市东湖新 技术开 发区茅店山西路8号创星汇科技园B- 203 (72)发明人 王一鸣　王陈　王梓澄　 (74)专利代理 机构 安徽昊程专利代理事务所 (普通合伙) 34281 专利代理师 王静 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) A01N 63/22(2020.01) A01P 1/00(2006.01) A01G 7/06(2006.01)A01G 22/22(2018.01) C05F 11/08(2006.01) C12R 1/085(2006.01) (54)发明名称 一种生防菌及其在水稻细菌性条斑病防治 方面的应用 (57)摘要 本发明公开了一种生防菌及其在水稻细菌 性条斑病防治方面的应用， 包括如下分离筛选步 骤： 初筛： 从常年发生水稻细菌性条斑病的田间 选取长势良好的水稻植株， 取其根围土， 根围土 风干， 取风干 过筛土10g， 放入含有9 0mL灭菌水的 三角瓶中， 置于摇床上振荡20 ‑30min， 即成10倍 悬液。 本发明通过生防菌， 可制成生防菌剂和微 生物菌肥， 对能产生水稻细菌性条斑病的农作物 进行防治， 以及应用于水稻的种植， 解决了现有 的水稻细菌性条斑病在防治时， 一般采用喷洒化 学药剂的方式进行， 采用此种方式， 容易对人畜 产生毒害， 污染农作物周边环境的土壤， 且化学 药剂容易残留， 给人们的后续食用带来安全隐 患， 以及不利于生态 环境可持续发展的问题。 权利要求书2页 说明书6页 附图1页 CN 115161249 A 2022.10.11 CN 115161249 A 1.一种生防菌， 其特 征在于包括如下分离 筛选步骤： 初筛： 从常年发生水稻细菌性条斑病的田间选取长势良好的水稻植株， 取其根围土， 根 围土风干， 取风干过筛土10g， 放入含有90mL灭菌水的三角瓶中， 置于摇床上振 荡20‑30min， 即成10倍悬液， 取10 ‑4、 10‑5浓度的悬浮液0.2mL加入已备好的LB培养基表面， 涂布平板， 28 ℃恒温培 养， 挑取不同菌落形态菌落备用； 复筛： 水稻细菌性条斑病RS105在培养基培养48h后， 接种至50mL培养液， 28 °C、 150r、 min−1振荡培养48h， 取0.3mL病原菌液均匀涂布在平板上， 然后在每个带菌平板上放置3个 灭菌的、 直径6mm的滤纸片， 在滤纸片上滴入10 μL含菌量为109cfu ⋅mL−1的拮抗菌液， 2 5°C培 养48h， 测量各菌株的抑菌圈直径； 分子生物学鉴定： 取上述筛选获得的生防菌菌体， 采用DNA快速提取试剂盒提取所收集 菌体的基因组DNA； 再采用PCR扩增试剂盒扩增该生防菌的gyrB基因片段， 以上述提取的基 因组DNA产物为模板； 扩增采用的正向引物序列为： 5 ‑GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNG GNAARTTYGA ‑3； 扩增采用的反向引物序列 为： 5‑AGCAGGATACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCR TCNGTCAT ‑3； 这两条引物序列中的 “N”表示A/G/C/T中的任意一种碱基， “R”表示A/G的中的 任意一种碱基， Y代表C/T中的任意一种碱基； 接着用水平电泳检测PCR产物， 扩增条带使用 DNA纯化回收试剂盒进行切胶回收， 回收的样品进行序列测定； 将测序结果进行同源性比 较， 最得出生防菌 。 2.根据权利要求1所述的一种生防菌， 其特征在于： 所述分子生物学鉴定步骤中， 同源 性比较时， 与已知细菌的gyrB基因片段序列进行相 似性比对， 所述初筛步骤中过筛的筛网 为2mm， 该生防菌为 为蜡质芽孢杆菌 。 3.根据权利要求1所述的一种生防菌， 其特征在于： 所述LB平板的配方为： 氯化钠10g/ L， 胰蛋白胨10g/L， 酵母 浸粉5g/L， 调节pH值 为7.2。 4.根据权利要求1 ‑3任一项所述的一种生防菌在水稻细菌性条斑病防治方面的应用， 其特征在于包括如下步骤： 培养： 将培育出的蜡质芽孢杆菌在LB平板上划线， 28℃ 生化培养箱中培养14 ‑16h， 待长 出单菌落后， 挑单菌落接入含有5mlLB培养液的试管中， 置于28℃、 200转/分钟的摇床上培 养48h， 作种子液； 按照1:100的比例将种子液接于500mL的LB培养液中， 置于28℃、 200转/分 钟的摇床上培 养48h， 至其活菌总浓度为5 ×109CFU/ml。 5.防治应用： 在农作物移栽后， 立刻用上述培养获得的菌液稀释100~200倍对移栽的农 作物进行灌根， 同时进行叶面喷施。 6.温室防病试验： 一： 用培养48h新鲜的细菌性条斑病菌RS105菌液接种成株期的水稻 植株， 每处理接种6 穴水稻， 24片叶， 接种后立即用培养36h、 含菌量为109c fu⋅mL−1的拮抗菌菌液进行 喷雾， 每 处理喷雾10 0mL菌液， 空白培 养液为对照； 14d后测量条斑病 病斑大小， 计算防治效果； 二： 用蜡质芽孢杆菌的菌液对生长14d的水稻进行灌根法处理， 每颗苗灌20ml； 此为实 验组； 三： 同时， 采用灌根法、 每颗苗浇灌20ml清水作为对照组； 四： 用新鲜培养的细菌性条斑病菌RS105菌液接种对上述三个实验中的水稻植株， 20 ‑ 25℃保湿， 每天观察各组情况， 待对照组出现发病情况后， 开始统计发病情况。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115161249 A 27.根据权利要求4所述的一种生防菌及其在水稻细菌性条斑病防治方面的应用， 其特 征在于： 所述温室防病试验中， 所提的步骤二为水稻细菌性条斑病试验的实验组， 所提的步 骤三为水稻细菌性条斑病试验的对照组。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115161249 A 3