(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210969928.5 (22)申请日 2022.08.12 (71)申请人 中国农业科 学院北京畜牧兽医研究 所 地址 100193 北京市海淀区 圆明园西路2号 (72)发明人 沈青春　蒋卉　丁家波　范学政　 张广智　鑫婷　梁琳　汤新明　 梁瑞英　李松励　秦彤　 (74)专利代理 机构 成都宏田知识产权代理事务 所(普通合伙) 51337 专利代理师 常利敏 (51)Int.Cl. G01N 33/531(2006.01) C12N 1/20(2006.01) G01N 33/569(2006.01)G01N 33/68(2006.01) C12R 1/35(2006.01) (54)发明名称 一种牛支原体平板凝集抗原及其制备方法 与应用 (57)摘要 本发明公开了一种牛支原体平板凝集抗原 及其制备方法与应用。 牛支原 体平板凝集抗原使 用牛支原体XBY01株制 成， 制备方法为将牛支原 体XBY01株传代后制 成种子菌液， 再接种牛支原 体培养基中扩大培养， 收获， 经活菌计数后， 离心 收获菌泥， 加入1/10倍体积的含0.01 ％硫柳汞的 PBS重悬灭活， 按活菌计数结果调整 抗原体积， 加 入终浓度0.03％的结晶紫溶液染色和菌液体积 10％的甘油， 混匀后分装保存。 本发明制备的牛 支原体平板凝集抗原， 具有较高的敏感性和特异 性， 操作简单， 结果易观察等优点， 适合于牧场的 牛支原体感染的快速筛查和检测。 发 明的工艺简 单、 成本低、 稳定性好， 适合于规模化生产和应 用。 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 CN 115327100 A 2022.11.11 CN 115327100 A 1.一种牛支原体平板凝集抗原， 其特征在于， 使用牛支原体XBY01株制成， 所述牛支原 体平板凝集抗原中含有牛支 原体XBY01株菌体的灭活前浓度为1.0 ×1011CCU/mL。 2.一种权利要求1所述的牛支原体平板凝集抗原的制备方法， 其特征在于， 包括以下步 骤： (1)将牛支 原体XBY01株传代后制成基础种子液； (2)将基础种子液接种于牛支 原体培养基中扩大培 养， 获得生产种子液； (3)将生产种子液进行发酵培 养， 并对菌液进行C CU计数和无菌检验； (4)在发酵培养菌液中加入含硫柳汞的PBS重悬灭活， 按CCU计数结果调整菌液浓度， 加 入结晶紫溶 液染色和甘油制备 得到牛支 原体平板 凝集抗原， 混匀后分装保存。 3.根据权利要求2所述的牛支原体平板凝集抗原的制备方法， 其特征在于， 具体包括以 下步骤： (1)基础种子液的制备： 取牛支原体XBY01株冻干菌种， 开启后， 按10％的量接种于牛支 原体培养基， 置37℃培养18～36h， 收获后作为一级基础种子， 将一级基础种子液按10％比 例再接种传代1次， 收获分装后置 ‑80℃冻存， 作为 二级基础种子； (2)生产种子液的制备： 取二级基础种子， 按10％比例接种于生产用牛支原体培养基， 置37℃恒温摇床， 120rpm震荡培 养18～36h至培养基变为黄色， 扩大培 养， 获得生产种子液； (3)发酵培养： 采用生物反应器大规模培养牛支原体XBY01株， 先对生物反应器进行灭 菌， 无菌加入牛支原体培养基， 按1:10的比例接种 生产种子液， 37℃恒温培养， 严格控制不 通气， 待pH下降至6.9～7.0时， 添加牛支原体培养基为原培养体积的20％， 进行两次补料培 养， 待第二次培 养pH下降到 6.7～6.8时收获菌液， 并对菌液进行C CU计数和无菌检验； (4)抗原制备： 在菌液中加入0.2～0.4％羟甲基纤维素钠， 置2～8℃静置7～10日， 8000rpm离心菌液10min， 取沉淀用含0.01％硫柳汞的PBS重悬， 调整菌液浓度为1.1 × 1011CCU/mL， 置37℃灭活3小时； 反复搅拌均匀后， 加入3 ％结晶紫溶液至终浓度 为0.03％进 行染色， 继续搅拌20分钟， 加入10％菌液体积的甘油， 继续搅拌10分钟， 即得到牛支原体平 板凝集抗原， 分装后置2 ～8℃保存。 4.权利要求1所述的牛支 原体平板 凝集抗原在牛支 原体感染检测中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115327100 A 2一种牛支原体平板凝集抗原及其制备方 法与应用 技术领域 [0001]本发明属于兽医诊断技术领域， 具体涉及 一种牛支原体平板凝集抗原及其制备方 法与应用。 背景技术 [0002]牛支原体病是由牛支原体引起的以犊牛肺炎、 关节炎、 成年奶牛乳腺炎等症状的 传染病， 发病率高， 犊牛感染死亡率可达20％。 牛支原体病在世界范围内普遍存在， 我国山 东、 河南、 湖北、 辽宁大部 分省市均有发生， 其主要传播途径是水平传播， 包括直接接触或经 呼吸道、 生殖道、 乳头传播。 胎儿可在分娩过程中接触带有牛支原体的母牛分泌物而感染， 新生犊牛还可 因吸吮或饮用了患有牛支原体乳腺炎乳汁而感染。 该病每年给我国养牛业造 成巨大的经济损失， 严重影响养牛和奶 业的健康发展。 [0003]当前我国已通过注册可用于牛支原体病检测的试剂盒有： 牛支原体环介导等温扩 增检测试剂盒和牛支原体ELISA抗体检测试剂盒两个品种， 但中国兽药信息网的国家基础 数据库(http://vdts.ivdc.org.cn:8081/cx/)显示， 自2019年至今， 均无生产和批签发记 录。 由此可判断当前我国批准生产的牛支原体检测试剂， 与实际需求存在差距， 无法满足当 前生产需要。 经与养殖企业和行业技术专家交流， 牛支原体检测需要的是能简单快速、 可视 化的现场检测试剂。 发明内容 [0004]针对现有技术中的上述不足， 本发明提供一种牛支原体平板凝集抗原及其制备方 法与应用。 选用牛支原体XBY01株研制开 发的平板凝集抗原及其对照血清， 用于牛血清中牛 支原体抗体的快速检测， 有助于解决我国当前 牛支原体感染检测 和防控中的问题。 [0005]为了达到上述发明目的， 本发明采用的技 术方案为： [0006]提供一种牛支原体平板凝集抗原， 其使用牛支原体XBY01株制成， 含牛支原体 XBY01株菌体灭活前活菌浓度为1.0 ×1011CCU/mL。 [0007]提供一种牛支 原体平板 凝集抗原的制备 方法， 包括以下步骤： [0008](1)将牛支 原体XBY01株传代后制成基础种子液； [0009](2)将基础种子液接种于牛支 原体培养基中扩大培 养， 获得生产种子液； [0010](3)将生产种子液进行发酵培 养， 并对菌液进行C CU计数和无菌检验； [0011](4)在发酵培养菌液中加入含硫柳汞的PBS重悬灭活， 按CCU计数结果调整菌液浓 度， 加入结晶紫溶 液染色和甘油制备 得到牛支 原体平板 凝集抗原， 混匀后分装保存。 [0012]进一步地， 牛支原体平板 凝集抗原的制备 方法具体包括以下步骤： [0013](1)基础种子液的制备： 取牛支原体XBY0 1株冻干菌种， 开启后， 按10％的量接种于 牛支原体培养基， 置37℃培养18～36h， 收获后作为一级基础种子， 将一级基础种子液按 10％比例再接种传代1次， 收获分装后置 ‑80℃冻存， 作为 二级基础种子； [0014](2)生产种子液的制备： 取二级基础种子， 按10％比例接种于生产用牛支原体培养说　明　书 1/5 页 3 CN 115327100 A 3