(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210610274.7 (22)申请日 2022.05.31 (71)申请人 中国矿业大 学 地址 221116 江苏省徐州市大 学路1号中国 矿业大学 (72)发明人 肖栋　何海伦　畢珈维　 (74)专利代理 机构 南京瑞弘专利商标事务所 (普通合伙) 32249 专利代理师 张联群 (51)Int.Cl. C12P 3/00(2006.01) C12N 1/20(2006.01) (54)发明名称 一种煤层菌群功能重塑的煤基生物质暗发 酵制氢方法 (57)摘要 一种煤层菌群功能重塑的煤基生物质暗发 酵制氢方法， 属于生物质制氢技术领域。 以煤层 中的产甲烷菌群为基础菌源， 通过煤炭 ‑生物质 联合诱导发酵， 使煤层菌群适应生物质发酵环境 并获得产甲烷菌群； 利用代谢底物驯化和敏感离 子与抗生素联合调控 方法， 进一步利用调控因子 诱导方法靶向切断非产氢产酸、 氢产甲烷和氢产 有机酸的关键噬氢代谢生物代谢点位， 重塑煤层 菌群代谢功能， 实现煤基产甲烷菌群代谢功能由 产甲烷转为产氢， 通过调控新构产氢菌群的优势 菌种结构平衡、 底物代谢选择性与利用率、 关键 代谢产物抑制因素， 实现高效、 稳定的煤基生物 质暗发酵制氢， 以及产氢工业化应用。 优点： 降低 了发酵制氢成本， 丰富了底物来源结构， 保障了 可持续生物制氢。 权利要求书3页 说明书9页 附图1页 CN 114958924 A 2022.08.30 CN 114958924 A 1.一种煤层菌群功能重塑的煤基生物质暗发酵制氢方法， 其特征是： 以煤层中的产甲 烷菌群为基础菌源， 通过煤炭 ‑生物质联合诱导 发酵， 使煤层菌群适应生物质发酵环境并获 得产甲烷菌群； 利用代谢底物驯化和敏感离子与抗生素联合调控方法， 进一步利用 调控因 子诱导方法靶向切断非产氢产酸、 氢产甲烷和氢产有机酸的关键噬氢代谢生物代谢点位， 重塑煤层菌群代谢功 能， 实现煤基产甲烷菌群代谢功能由产甲烷转为产氢， 通过调控新构 产氢菌群的优势菌种结构平衡、 底物代谢选择性与利用率、 关键代谢产 物抑制因素， 实现高 效、 稳定的煤基生物质暗发酵制氢， 以及产氢工业 化应用。 2.根据权利要求1所述的一种煤层菌群功能重塑的煤基生物质暗发酵制氢方法， 其特 征是： 具体步骤如下： 步骤1、 煤基产甲烷菌群获取 菌样获取煤层中选择新剥露煤， 采用掏槽法取直径介于5 ‑10cm的块状煤样10kg， 煤样 即刻封存在厌氧无菌罐 内； 罐内初始采用100％浓度的CO2填充， 煤样放入后， 氮气置换并检 测CO2浓度， 直到罐内CO2浓度小于1％； 煤样保持密封并且保存温度小于30℃ 条件下送至预 培育实验室； 步骤2、 煤基煤炭 ‑生物质联合产甲烷发酵菌种诱 导 首先， 以煤为底物在煤样中培育出产甲烷菌群； 然后， 每7 ‑14天为周期按照10 ％梯度逐 渐增加无菌生物质含量， 使煤层的产甲烷菌逐步适应生物质底物； 当煤： 生物质的质量比＝ 1:9， 并且生物气中的甲烷浓度稳定>50％， 完成煤基煤炭 ‑生物质联合产甲烷 发酵菌种的诱 导； 所述的煤基煤炭 ‑生物质联合产甲烷发酵菌种简称为煤基产甲烷发酵菌群； 步骤3、 煤基产甲烷发酵菌群中关键 菌种分离与菌株 类型鉴定 在煤基产甲烷发酵菌群中， 分离富集纤维素与半纤维素水解菌、 产氢菌、 非产氢产酸 菌、 噬氢产酸菌和产甲烷菌菌株， 每种富集菌株的相对丰度>97.00％； 所述的分离富集无需 菌种纯化； 利用微生物多样性分析方法确立煤基产 甲烷发酵菌群及个关键菌种的菌株类 型； 步骤4、 生物质降解中的关键 H代谢通路与主 要产氢功能菌类别 利用代谢通路分析方法分析煤基产甲烷发酵菌的产甲烷代谢通路， 厘清生物质产甲烷 代谢通路中的产H2与噬H2代谢分布， 确立典型厌氧产氢途径在H代谢通路中的点位分布与分 配权重， 甄别出生物质产氢菌主 要门和属的水平类型； 步骤5、 确立噬氢的关键生物学点 位与功能菌种类别 结合H代谢通路与关键产氢菌类型， 确立H2产CH4和H2产乙酸或丁酸的关键生物学点位， 明确产甲烷菌群代谢中主 要噬氢点 位构成菌种类别； 步骤6、 主 要菌种的生物学 特征分析与群落协作关系 明晰纤维素与半纤维素水解菌、 产氢菌、 非产 氢产酸菌、 噬氢产酸菌和产甲烷菌的生物 学特征， 揭示围绕目标生物学点 位的产H2产乙酸‑噬H2菌间共生 ‑协作拓扑关系； 步骤7、 噬氢靶向点 位阻断的调控培 养基配置与诱 导方法 分析纤维素与半纤维素水解菌、 产氢菌、 非产 氢产酸菌、 噬氢产酸菌和产甲烷菌对环境 因子变化的响应规律； 结合步骤6 分析的目标菌种生物学特征， 利用敏感源分析方法探寻纤 维素与半纤维素水解菌和产氢菌耐受性优良、 但 能显著抑非产氢产酸菌、 噬氢产酸菌和产权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 114958924 A 2甲烷菌的敏感因子， 确立调控培养基配置方法； 结合步骤6和本步骤测定的主要菌株的生长 速率差异， 建立定向抑制产甲烷菌、 靶向阻断H2产CH4和H2产有机酸代谢节 点、 弱化非产氢产 酸菌的诱 导方法； 步骤8、 煤基产氢菌群的构建和生物多样性， 明晰稳定产氢调控方法 明晰菌群功能由产甲烷至产 氢调控过程中， 优势菌构 成和菌间协作关系 对代谢点位调 控的随动响应规律， 构建稳定生物质水解、 强化产H2、 抑制非产氢产酸、 抑制H2产CH4和H2产 有机酸的产氢菌诱导培养基配制方法与精准调控方法， 厘清新构菌群中优势菌形成内因、 菌群平衡条件和自稳能力， 优化并明确疏通煤产H2代谢通路， 阻断噬H2代谢点位的复合因子 调控重构 菌群功能中核心代谢通路转换模式和群落结构演化规律； 以第二步骤获取的煤基 产甲烷发酵菌群为基础， 诱 导构建煤基产氢菌群； 步骤9、 生物质制氢底 物降解选择性与最优底 物H2转化率分析 针对新构的煤基产氢菌群， 通过理论推导、 计算模拟、 生物质底物基团赋存分析手段， 对比H2产CH4靶向阻断前后菌群对底物基团利用选择性异同， 明晰产氢菌群营养获取倾向 性， 结合产氢菌代谢模式推导出最优底 物H2转化率； 步骤10、 代谢产物分压对H2转化率影响分析 探索产氢发酵指纹代谢产物分压对生物质产 氢的影响规律， 明晰煤基产 氢菌群对生物 质类别变化的耐受 能力， 确立稳定产氢速率与提升底物有效转化率的关键代谢产 物影响因 素与控制条件； 所述的产 氢发酵指纹代谢产物分压包括： H2分压、 CO2分压、 乙酸或乙酸盐分 压、 丁酸或丁酸盐分压； 步骤11、 煤基产氢菌的生物质制氢技 术方案优化与确立 构建待实施生物质类别的理想产氢菌群结构模型和多样性驱动因素模型， 优化实现底 物产氢最大化的调控方法， 多循环相似模拟分析优化调控下产氢菌群的结构稳定性与 功能 可靠性， 确立煤基产氢菌的生物质制氢技 术方案； 步骤12、 煤基产氢菌构建的生物质制氢技 术实施 根据煤基产氢菌构建的生物质制氢技 术方案： 步骤12‑1、 将步骤8构 建的煤基产氢菌群进行扩培， 根据发酵罐体容积， 扩培菌液量>罐 体总容积10％； 步骤12‑2、 随机抽取10个扩培菌样进行生物质产氢稳定性试验， 当每试样的H2含量> 55％、 底物氢转化率与转化量最大波动<10％时， 菌种扩培满足工业 化菌种引入要求； 步骤12‑3、 按照10％的菌种引入率在发酵罐内接种煤基产氢菌群， 并且罐底铺设1米 厚、 粒径10 ‑20cm的菌样获取煤作为煤基产氢菌 菌床与缓冲介质， 实施煤基生物质制氢； 其中， 煤基产氢菌的生物质制氢技术是以煤样获取煤层的地温和pH条件为基础， 生物 质暗发酵制氢能够 在24‑30℃温度下 稳定运行； 步骤12‑4、 实时抽排气体代谢产物， 使罐体内的气体压力保持在1.05 ‑1.10atm标准大 气压； 步骤12‑5、 实时监控罐体液体的水溶性代谢产物分压， 利用稀释法、 中和法、 或乙酸、 丁 酸分离法控制罐内水 溶性代谢产物浓度， 实现高效稳定生物质制氢技 术的实施。 3.根据权利要求2所述的一种煤层菌群功能重塑的煤基生物质暗发酵制氢方法， 其特 征是： 步骤1中， 菌样获取煤层的选择需同时满足以下要求： (1)煤层埋深>600m； (2)煤层温权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 114958924 A 3