(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211021577.1 (22)申请日 2022.08.24 (71)申请人 安徽普洛生物科技有限公司 地址 247260 安徽省池州市东至 县经济开 发区 申请人 浙江普洛生物科技有限公司 　 普洛药业股份有限公司 (72)发明人 何敏　孟荣　翟倩　麻荣军　 陆凌霄　许丹英　吕立获　李兴武　 胡佳鹏　 (74)专利代理 机构 杭州知闲专利代理事务所 (特殊普通 合伙) 33315 专利代理师 张勋斌 (51)Int.Cl. C12Q 1/04(2006.01)C12N 13/00(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种混检 筛选高产菌 株的方法 (57)摘要 本发明公开了一种混检筛选高产菌株的方 法， 所述混检筛选方法包括， 菌悬液经过诱变后 加入菌种适宜浓度抗性物质， 混合均匀 后置于含 培养基的容器中振荡培养， 通过判断生长参数挑 选适宜的菌群， 选择菌群分离单菌落获得高产的 纯化菌种。 所述菌悬液为单细胞或单孢子菌悬 液； 所述诱变包括物理诱变、 化学诱变、 生物诱变 的方法； 所述抗性物质指能够杀死或抑制生产菌 株的物质； 所述适宜浓度指能够杀死或抑制生产 菌株的浓度； 所述菌群指生长参数满足筛选要求 的菌体培养液， 此方法提高菌种筛选效率， 从而 提高菌株目标产物的产量。 本发 明的方法适用于 不同菌株或不同目的产物的菌种筛 选。 权利要求书1页 说明书6页 CN 115466775 A 2022.12.13 CN 115466775 A 1.一种混检筛 选高产菌株的方法， 其特 征在于， 包括： 菌悬液经过诱变后加入抗性物质， 混合均匀后置于含培养基的容器中振荡培养， 通过 检测不同容器中菌群生长参数， 挑选适宜的菌群， 菌群分离单菌落获得 纯化的高产菌种。 2.根据权利要求1所述的混检筛选 高产菌株的方法， 其特征在于， 所述菌悬液是单细胞 或单孢子 菌悬液。 3.根据权利要求1所述的混检筛选 高产菌株的方法， 其特征在于， 所述诱变包括物理诱 变、 化学诱变、 生物诱变的方法； 所述抗性物质为目标产物， 副产物， 前体， 前体结构类似物， 底物， 代谢中间体， 抗生素 中的一种或者多种。 4.根据权利要求1所述的混检筛选 高产菌株的方法， 其特征在于， 所述的菌悬液中的菌 株为多粘类芽孢杆菌； 所述的诱变为 紫外光照射或/和E MS溶液处理； 所述的抗 性物质为α ‑氨基丁酸或/和链霉素。 5.根据权利要求 4所述的混检筛 选高产菌株的方法， 其特 征在于， 包括以下 具体步骤： (1)将含多粘类芽孢杆菌的菌悬液用EMS溶液处理， 接种于种子培养基， 同时加入α ‑氨 基丁酸， 分装于酶标板中， 进行摇床振荡培养， 然后用酶标仪检测菌种生长状态， 筛选出未 受到抑制的菌群1； (2)将步骤(1)得到的菌种1制备菌悬液， 然后采用紫外光进行照射， 再接种于种子培养 基， 同时加入α ‑氨基丁酸， 分装于酶标板中， 进行摇床振荡培养， 然后用酶标仪检测 菌种生 长状态， 筛 选出未受到抑制的菌群2； (3)将步骤(2)得到的菌种2制备菌悬液， 依次用紫外光进行照射和EMS溶液处理， 再接 种于种子培养基， 同时加入α ‑氨基丁酸和链霉素， 然后用酶标仪检测菌种生长状态， 筛选出 未受到抑制的菌群3； 所述菌群1、 菌群2和菌群3通过分离发酵培 养筛选得到所述的高产菌株。 6.根据权利要求5所述的混检筛选高产菌株的方法， 其特征在于， 步骤(1)～(3)中， 所 述的发酵培 养筛选包括菌种效价的检测过程。 7.根据权利要求4～5任一项所述的混检筛选高产菌株的方法， 其特征在于， 所述的紫 外光的功率 为15～20W， 照射时间为3 0～90s。 8.根据权利要求4～5任一项所述的混检筛选高产菌株的方法， 其特征在于， 所述EMS溶 液的浓度为0.0 5～0.15mo l/L。 9.根据权利要求4～5任一项所述的混检筛选高产菌株的方法， 其特征在于， α ‑氨基丁 酸的终浓度为0.4～0.6％； 所述链霉素的浓度为80～10 0u/mL。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115466775 A 2一种混检筛选高产菌株的方 法 技术领域 [0001]本发明属于微 生物领域， 具体涉及一种混检筛 选高产菌株的方法。 背景技术 [0002]菌种筛选是用不 同的方法选出具有特殊性能的菌株， 对于工业微生物而言， 菌株 筛选是提高菌株生产能力的重要途径之一， 在发酵工业中占有重要地位， 菌种筛选技术对 于提高发酵产品的产量和质量， 以及进一步开发利用微生物资源， 增加发酵工业产品的品 种， 具有重大意 义。 [0003]诱变育种是以人工诱变手段诱发微生物基因突变， 改变遗传结构和功能， 通过筛 选产量高性状优良的变异突变株。 诱变育种作为传统微生物育种方法， 到目前仍作为重要 的菌种筛选策略和手段， 尤其现代发酵行业迅猛发展的今天， 诱变育种同分子改造和高通 量筛选等先进技术结合， 获得很好的效果。 传统的菌种筛选一般包括两个步骤， 即初筛和复 筛。 初筛是去除明显不符合要求的大部 分菌株， 保留能力高或相近的菌株， 复筛是确认符合 生产要求的菌株。 [0004]常规的菌种筛选流程是出发菌株经过诱变后分离单菌落， 对单菌落进行摇瓶或孔 板等方式培养， 进行产量评估后筛选高产菌株， 这种 方法具有工作量大， 筛选效率低， 漏筛 几率高等问题。 发明内容 [0005]本发明提供了一种混检筛选高产菌株的方法， 该方法筛选效率高， 工作量小， 提高 了生产菌株的产量。 [0006]一种混检筛选高产菌株的方法， 菌悬液经过诱变后加入抗性物质， 混合均匀后置 于含培养基的容器中振荡培养， 通过检测不同容器中菌群生长参数， 挑选适宜的菌群， 菌群 分离单菌落获得 纯化的高产菌种。 [0007]本发明中， 常规菌种筛选的基础上首先利用高通量方法筛选具有抗性物质的抗性 菌株群， 以菌种的生长情况初步判断菌株的抗性能力， 所筛选的抗性菌株群进行发酵产能 检验， 筛选更佳的菌株群， 然后对菌株群进行分离， 用摇瓶或高通量等方法筛选高产菌株， 同时对所筛 选的菌株进行抗 性能力验证。 [0008]优选的， 菌悬液为单细胞或单孢子菌悬液， 菌悬液单细胞或单孢子的浓度为107～ 108个/ml。 [0009]优选的， 诱变包括物理诱变、 化学诱变、 生物诱变的方法。 [0010]优选的， 所述抗性物质指能够杀死或抑制生产菌株的物质； 进一步优选为目标产 物， 副产物， 前体， 前体结构类似物， 底 物， 代谢中间体和抗 生素中的一种或者多种。 [0011]优选的， 所述抗性物质的浓度指能够杀死或抑制生产菌株物质的浓度； 进一步优 选为最低抑制浓度。 [0012]优选的， 所述含培养基的容器指能够进行细胞培养的设备， 进一步优选为摇瓶， 试说　明　书 1/6 页 3 CN 115466775 A 3