(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211148443.6 (22)申请日 2022.09.20 (71)申请人 南京农业大 学 地址 210093 江苏省南京市玄武区卫岗1号 (72)发明人 郑冠宇　李昉娟　周立祥　 (74)专利代理 机构 江苏瑞途律师事务所 32346 专利代理师 李童 (51)Int.Cl. C02F 3/34(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12R 1/19(2006.01) C12R 1/01(2006.01) C12R 1/40(2006.01) (54)发明名称 一种水中胞外抗 生素抗性基因的去除方法 (57)摘要 本发明公开了一种水中胞外抗生素抗性基 因的去除方法， 属于环境治理领域。 该方法是向 水中添加细胞裂解物， 尤其是大肠杆菌的细胞裂 解物， 细胞裂解物中包括核糖核苷酸外切酶I、 核 糖核苷酸外切酶 Ⅲ和DNA拓扑异构酶I等多种酶， 可以降解胞外抗生素抗性基因。 此外， 针对细胞 裂解物在水溶液中稳定性差、 水成分复杂容易使 细胞裂解物中酶失活等问题， 本发 明提供了聚丙 烯酰胺(PAM)水凝胶固定化的细胞裂解物， 对细 胞裂解物进行保护， 能够有效削减污水中的胞外 抗生素抗性基因， 并且可以重复利用。 权利要求书1页 说明书7页 附图3页 CN 115417510 A 2022.12.02 CN 115417510 A 1.一种水中胞外抗生素抗性基因的去除方法， 其特征在于， 向水中添加细菌的细胞裂 解物， 所述细菌包括大肠杆菌、 不动杆菌、 恶臭假单胞菌以及氧化亚铁硫杆菌中一种或者多 种， 所述细胞裂解物中含有降解DNA的酶， 所述水的温度为28℃～37℃。 2.根据权利要求1所述的一种水中胞外抗生素抗性基因 的去除方法， 其特征在于， 所述 大肠杆菌为E.coli  MG1655、 不动杆菌为Acinetobacter  baylyi ADP1、 恶臭假单胞菌为 Pseudomonas putida KT2440以及氧化亚铁硫杆菌为Acidithiobacillus  ferrooxidans   LX5。 3.根据权利要求1或2所述的一种水中胞外抗生素抗性基因的去 除方法， 其特征在于， 所述细胞裂解物通过 水凝胶固定后再加入水中。 4.根据权利要求3所述的一种水中胞外抗生素抗性基因 的去除方法， 其特征在于， 所述 水凝胶为聚丙烯酰胺水凝胶。 5.根据权利要求4所述的一种水中胞外抗生素抗性基因 的去除方法， 其特征在于， 所述 水凝胶固定的方法为取细胞裂解物， 加入丙烯酰胺、 N,N ’ ‑双丙烯酰胺和K2S2O8， 使用N2对混 合液曝气后凝胶合成。 6.根据权利要求1 ‑5任一所述的一种水中胞外抗生素抗性基因的去 除方法， 其特征在 于， 所述细胞裂解物通过破碎细胞而制备， 细胞破碎的方法为超声破碎， 超声破碎的条件为 仪器参数设定为功率10％～40％， 温度为0℃～4℃， 每工作3.0s～5.0s， 间歇5.0s～9.9s， 超声时间为5mi n～10min。 7.一种菌剂， 其特征在于， 包括权利要求1 ‑6中任一所述的细胞裂解物或者固定后的细 胞裂解物。 8.权利要求7 所述的菌剂在含胞外抗 生素抗性基因废水处 理中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115417510 A 2一种水中 胞外抗生素 抗性基因的去除方 法 技术领域 [0001]本发明属于环境治理技术领域， 具体涉及 一种水中胞外抗生素抗性基因的去除方 法。 背景技术 [0002]抗生素广泛应用于医疗、 水产养殖和畜牧业， 极大地促进了人类健康和农业生产。 但抗生素的过度使用和滥用不可避免使未被利用的抗生素进入环境中， 诱导和加速了抗生 素抗性菌(Antibiotic  resistant  bacteria， ARB)和抗生素抗性基因(Antibiotic   resistance  genes， ARGs)产生。 抗生素抗性(Anti microbial  resistance， AR)日益严重。 世 界卫生组织(WH O)强调抗生素抗性具有复杂性、 多面性， 是人类社会发展面临的重大威胁之 一。 直到20 06年， ARGs才被公认为 新兴环境污染物。 [0003]环境中ARGs主要以胞内DNA和胞外DNA两种形式存在， 胞内抗生素抗性基因 (Intracellular  antibiotic  resistance  genes,iARGs)主要存在ARB体内的染色体或可 移动遗传元件(Mobile  genetic elements,MEGs)上， 胞外抗生素抗性基因(Extrac ellular  antibiotic  resistance  genes,eARGs)一般存在于环境中的MEGs或裸露于环境介质中。 iARGs通过接合和转导的方式促进ARB的增殖， 而eARGs常通过转化被细菌吸收从而促进抗 生素抗性基因的传播。 [0004]目前， eARGs的风险日趋显著， 在诸多环境中均被检测到。 据报道 畜禽粪便中eARGs 丰度高达1.7 ×103～4.2×108copies/g干污泥。 经过不同调理方式(如生物沥浸等)等方法 虽可高效去除污泥中iARGs， 而氨基糖苷类和四环素等类eARGs丰度仍高达107copies/L。 类 似地， 污水处理厂中膜生物反应器处理后的出水中检测到的eDNA含量为4.2ng/mL。 消毒是 去除污染物从而提高污水处理厂二级出水质量的重要单元， 而有研究发现经过消毒处理 后， eARGs丰度还出现上升 趋势。 [0005]已有大量研究评估了不同方法对水中ARGs的去除， 主要涉及物理法(如混凝等)、 化学法(如氧化、 芬顿、 光催化等)、 物理 ‑化学联合法(如UV辐射、 电离辐射等)和生物法(如 膜生物反应器和人工湿地等)等。 某些混凝剂可以有效去除ARGs， 如聚合氯化铝， 但去除效 率跟混凝剂投加剂量显著相关， 成本较高， 不具有经济可行性。 而对于臭氧氧化等化学处 理， 如vanA和blaVIM经O3处理后相对丰度 提高， O3消毒对ARGs处理效果受臭氧浓度、 接触时 间、 pH、 悬浮物以及腐殖酸浓度等多种因素的影响， 由于其传质速率有限且水溶性低， O3实 际利用率并不高。 某些光介导的高级 氧化虽然可以有效移除ARGs， 例如UV/H2O2、 UV/TiO2、 光 催化以及光芬顿对ARGs的去除为0.83 ‑5.59logs， 但成本较高。 基于UV的光催化耗能较高， 同时废水的浊度抑制UV 穿透。 UV消毒 过程不会产生消毒副产 物， 对环境友好， 但有研究表明 常规UV消毒剂量对四环素类、 磺胺类、 红霉素类等多种抗性基因均无去除效果。 膜生物反应 器和人工湿地去除ARGs的效率受运行参数限制， 包括水力停留时间和水力负荷等， 同时污 染膜中可溶性微生物产物和胞外聚合物浓度对ARGs的去除有很大影响。 在人工湿地处理 中， 植物种类、 种植模式和湿地类型均会造成一定的影响。 尽管目前已经有很多技术可以在说　明　书 1/7 页 3 CN 115417510 A 3