(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210860546.9 (22)申请日 2022.07.21 (71)申请人 信阳农林学院 地址 464006 河南省信阳市平桥区北环路1 号 (72)发明人 王春生　张巧玉　智亚楠　赵筱岑　 尤伟晨　史洪中　王国君　陈利军　 (74)专利代理 机构 郑州豫原知识产权代理事务 所(普通合伙) 41176 专利代理师 轩丽杰 (51)Int.Cl. C12Q 1/04(2006.01) C12N 1/02(2006.01) C12N 1/20(2006.01) A01G 13/00(2006.01)C12R 1/125(2006.01) (54)发明名称 一种植物病害生物防治菌 株的筛选方法 (57)摘要 本发明涉及防治菌株实验技术领域， 且公开 了一种植物病害生物防治菌株的筛选方法， 所述 筛选方法包括以下步骤： S1： 筛选培养基； S2： 制 备锭粉培养基后， 进行紫外线灭菌20min； S3： 制 备土壤稀释液， 选取果园内、 花坛地方的土样， 铲 产去表层， 取5～15CMM处5 克的土壤样品， 加入事 先灭菌好的装有100mL无菌水的250mL的三角瓶 内， 30℃恒温振荡2 00rpm， 将菌胶团打碎， 得泥水 混合物， 备用； S4： 将泥水混合物转入装有100mL 筛选培养基的500mL锥形瓶中， 30℃恒温静置培 养至培养基浑浊， 得到菌 悬液； S5： 获得菌种； S6： 单个菌种初筛； S7： 接种到斜面培养基中， 放入3 7 ℃的恒温培养箱中培养2～7天， 得到枯草芽孢杆 菌防治菌 株再加入苹果 植物苗。 权利要求书2页 说明书6页 附图3页 CN 115109827 A 2022.09.27 CN 115109827 A 1.一种植物病害生物防治菌株的筛 选方法， 其特 征在于： 所述筛 选方法包括以下步骤： S1： 筛选培养基， 将4g/牛肉膏、 10g/L蛋白胨、 5G/L氯化钠、 可溶性淀粉10.0g、 蒸馏水 1000ml和加入氧菌20g琼脂， 将锭粉用少量蒸馏水调成糊状， 再加入到融化好的培养基中， 将培养基导入培 养皿中； S2： 制备锭 粉培养基后， 进行紫外线灭菌20mi n； S3： 制备土壤稀释液， 选取果园内、 花坛地方的土样， 铲产去表层， 取5～15CMM处5克的 土壤样品， 加入事 先灭菌好的装有100mL无菌水的250mL的三角瓶内， 30℃恒温振荡200rpm， 将菌胶团打碎， 得泥水混合物， 备用； S4： 将泥水混合物转入装有100mL筛选培养基 的500mL锥形瓶中， 30℃恒温静置培养至 培养基浑浊， 得到 菌悬液； S5： 将得到 菌悬液放置于30℃培养箱中使菌液吸附进培 养基中培 养1～3天， 获得菌种； S6： 单个菌种初筛， 观察菌落表面， 若发现有杂菌， 进行再一次地分离纯化； 观察有锭粉 圈的菌落， 并测量淀粉圈的直径D， 菌落直径r， 计算D/r的比值， 进而进行拍照， 选择淀粉圈 大的菌落作为后续实验的菌种； S7： 接种到斜面培养基中， 放入37℃的恒温培养箱中培养2～7天， 得到枯草芽孢杆菌防 治菌株。 2.根据权利要求1所述的一种植物病 害生物防治菌株的筛选方法， 其特征在于： 在S2和 S3步骤中间加入恒温振荡器进行培 育。 3.根据权利要求1所述的一种植物病 害生物防治菌株的筛选方法， 其特征在于： 所述S1 步骤中筛 选培养基均含有2％可 溶性锭粉的LB培 养基的两种方案： a)豆饼粉4％， 玉米粉3％， Na2HPO40.8％， (NH4)2SO40.4％， NH4Cl0.15％， H2O b)豆饼粉5.6％， 玉米粉7.2％， Na2HPO40.8％， (NH4)2SO40.4％， NH4Cl0.13％， CaCl20.13％， α —淀粉酶5 0g。 4.根据权利要求1所述的一种植物病 害生物防治菌株的筛选方法， 其特征在于： 所述S1 步骤中包括称重单元， 所述称重单元用于将所需培养基的配方通过玻棒挑取、 放入器皿和 称量纸上进行称量， 称量后放入蒸馏水中， 再将 称量纸分离。 5.根据权利要求1所述的一种植物病 害生物防治菌株的筛选方法， 其特征在于： 所述S1 步骤中还包括溶化单元， 所述溶化单元用于将所需克数 的可溶性淀粉放入一个小烧杯 中， 加入少量蒸馏水， 搅拌成糊状， 然后将糊状溶液均匀倒入少于培养基总体积的沸水中， 一边 搅拌一边加热， 待其溶化成透明状后继续在电炉上加热5分 即制成可 溶性淀粉溶 液。 6.根据权利要求1所述的一种植物病 害生物防治菌株的筛选方法， 其特征在于： 所述S4 步骤中用过接种环取菌种， 放入10 00ml无菌水的三角瓶中， 振摇； 用一支1ml无菌吸管吸取1ml菌液加入盛有10ml无菌水的大试管中充分混匀， 然后用无 菌吸管从此试管中吸取1ml加入另一盛有10ml无菌水的试管中， 混合均匀， 以此类推制成 10‑1、 10‑2、 10‑3、 10‑4、 10‑5、 10‑6不同稀释度的菌液。 7.根据权利要求1所述的一种植物病 害生物防治菌株的筛选方法， 其特征在于： 所述S4 步骤中将平板底 面分别用记 号笔写上10 ‑4、 10‑5、 10‑6三种稀释度， 然后用接种环分别沾取 浓度为10 ‑4、 10‑5、 10‑6稀释液并对号在相应平板上划 线， 室温下静止5～10min， 使菌液 吸 附进培养基。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115109827 A 28.根据权利要求1所述的一种植物病 害生物防治菌株的筛选方法， 其特征在于： 所述S6 步骤中的筛 选鉴定两种方法： c)形态学鉴定， 通过形状、 大小、 颜色、 透明度、 边缘特征进行记录， 同时用接种环挑取 单菌落进行革兰氏染色、 镜检和记录结果； b)生理生 化鉴定、 通过 过氧过氢酶测定法进行检测。 9.根据权利要求1所述的一种植物病 害生物防治菌株的筛选方法， 其特征在于： 所述S1 ～S7中用到的设备包括恒温振荡器、 高压蒸气灭菌器、 无菌操作台、 PH测 定仪、 电子称重器 和紫外分光 光度计。 10.根据权利要求1所述的一种植物病害生物防治菌株的筛选方法， 其特征在于： 在S7 步骤中得到的枯 草芽孢杆菌防治菌株时加入苹果 植物苗。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115109827 A 3