(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210872869.X (22)申请日 2022.07.21 (83)生物保 藏信息 CCTCC NO： M 202 2622 2022.05.13 (71)申请人 厦门惠盈动物科技有限公司 地址 361000 福建省厦门市集美区灌口大 道3108号 (72)发明人 庄若飞　林松泉　刘兵　李惠静　 曾海燕　 (74)专利代理 机构 厦门市天富勤知识产权代理 事务所(普通 合伙) 35244 专利代理师 李宁 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12N 15/01(2006.01)C12N 13/00(2006.01) C12Q 1/40(2006.01) C12Q 1/34(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) C05F 15/00(2006.01) C05F 17/20(2020.01) C05F 17/80(2020.01) A01N 63/22(2020.01) A01P 1/00(2006.01) A61K 35/742(2015.01) A61P 31/04(2006.01) C12R 1/125(2006.01) (54)发明名称 一种枯草芽孢杆菌 菌株、 菌粉及其应用 (57)摘要 本发明提供一株枯草芽孢杆菌菌株， 为枯草 芽孢杆菌(Bacillus  subtilis)HY ‑001， 保藏于 中国典型培养物保藏中心(CCTCC)， 保藏编号为 CCTCC NO.M 2022622， 保藏日期为2022年05月13 日。 由广东省微生物菌种保藏中心采购编号为 GDMCC1.372， 经过紫外诱变、 50℃高温诱导及高 产纤维素酶、 淀粉酶的筛选获得。 该枯草芽孢杆 菌HY‑001能耐受50℃高温， 且对多种弧菌 具有明 显抑制效果， 故在堆肥腐熟及水产防治弧菌具有 重要意义。 权利要求书1页 说明书7页 附图3页 CN 115109730 A 2022.09.27 CN 115109730 A 1.一株枯草芽孢杆菌菌株， 其特征在于， 所述枯草芽孢杆菌菌株为枯草芽孢杆菌 (Bacillus  subtilis)HY‑001， 保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)， 保藏编号为CCTCC   NO.M2022622， 保藏日期为202 2年05月13日。 2.根据权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌菌株， 其特征在于， 所述枯草芽孢杆菌HY ‑ 001， 由广东省微生物菌种保藏中心采购编号为GDMCC1.372， 经过紫外诱变、 50℃高温诱导 及高产纤维素酶、 淀粉酶的筛 选获得。 3.根据权利要求2所述的一种枯草芽孢杆菌菌株， 其特征在于， 紫外诱变： 取培养24h的 枯草芽孢杆菌GDMCC1.372培养液， 采用10倍稀释至10‑3制成菌悬液； 取直径9cm无菌平皿1 套， 加入上述10‑3菌悬液2mL， 用无菌涂布棒涂成薄薄一层； 置于在距离 为30cm， 功率为15 W的 紫外线灯下照射3min， 在照射前将紫外线灯开关打开预热约20min； 用无菌涂布棒蘸取菌液 快速涂布于牛肉膏蛋白胨琼脂 培养基平板中， 操作过程 不开白炽灯， 保持暗光线操作。 4.根据权利要求2所述的一种枯草芽孢杆菌菌株， 其特征在于， 50℃高温诱导： 将上述 涂匀的平板， 用黑布包好， 置50℃培养48h； 将50℃培养后在平板上长出来的枯草芽孢杆菌 菌落， 全部挑取至 30mL营养肉汤培 养基， 100mL三角瓶装， 5 0℃摇床培 养24h备用。 5.根据权利要求2所述的一种枯草芽孢杆菌菌株， 其特征在于， 产淀粉酶筛选： 将50℃ 高温诱导培养后的菌液， 进行10倍稀释， 选取10‑4、 10‑5、 10‑6各0.1mL涂布淀粉酶培养基， 50 ℃培养48h， 将碘液滴加平板上， 观察测量透明圈大小； 将产生较大透明圈的菌株进行纯化 分离备用； 其中淀粉酶筛选培养基： 可溶性淀粉10g、 牛肉膏3g、 蛋白胨10g、 氯化钠5g、 琼脂 20g。 6.根据权利要求2所述的一种枯草芽孢杆菌菌株， 其特征在于， 产纤维素酶筛选： 将在 淀粉酶筛选试验中纯化后的菌株进行活化培养18h， 进行10倍稀释， 选取10‑4、 10‑5、 10‑6各 0.1mL涂布纤维素酶筛选培养基， 50℃培养48 h， 观察测量透明圈大小； 将产生较大透明圈的 菌株进行纯化分离备用； 其中纤维素酶筛选培养基： 羧甲基纤维素钠10g、 酵母膏1 g、 刚果红 0.2g、 硫酸铵4g、 磷酸 二氢钾2g、 硫酸镁0.5g、 硫酸锰0.5g、 琼脂20g、 pH  5.5。 7.一种枯草芽孢杆菌菌粉， 其特征在于， 将权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌HY ‑001 摇瓶活化后接入10L种子罐， 装发酵液4L， 发酵结束后按4％接入200L发酵罐， 装发酵液 100L； 发酵温度40℃， 发酵25h， 搅拌150r/min， 溶氧80％； 发酵结束通过碟式离心机离心收 集菌泥后通过离心式喷雾干燥机喷雾制备成菌粉， 其中控制进风温度110℃， 出风温度70 ℃。 8.根据权利要求7所述的一种枯草芽孢杆菌菌粉， 其特征在于， 所述发酵液原料包括： 葡萄糖25g/L， 酵母浸膏5g/L， 复合氨基酸粉2g/L， 氯化铵2g/L， 硫酸镁0.1g/L， 硫酸锰 0.05g/L， 碳酸钙3g/L， pH自然。 9.根据权利要求7所述的一种枯草芽孢杆菌菌粉， 应用 在抑制副溶血弧菌、 溶藻弧菌、 铜绿假单 胞菌、 嗜水气单 胞菌。 10.根据权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌菌株， 应用在抑制副溶血弧菌、 溶藻弧菌、 铜绿假单 胞菌、 嗜水气单 胞菌。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115109730 A 2一种枯草芽孢杆菌 菌株、 菌粉及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及一株能耐受高温的枯 草芽孢杆菌 菌株及其制备的菌粉和应用。 背景技术 [0002]枯草芽孢杆菌(Bacillus  subtilis)， 是一种好氧的革兰氏阳性芽孢 杆菌， 其菌体 生长过程中产生的枯草菌素与多粘菌素等活性物质， 能对致病菌或 内源性感染的条件致病 菌有明显的抑制作用。 枯草芽孢杆菌代谢可合成α ‑淀粉酶、 蛋白酶、 纤维素酶等多种酶类， 在消化道中提高消化能力， 且能分解有机物及有 毒有害物质。 [0003]从目前现有的研究报道中可见， 枯草芽孢杆菌的生长 温度一般在10 ‑40℃， 而耐高 温的报道主要 是其代谢酶类或其形成的芽孢状态， 至于非芽孢状态的菌体能耐受高于50℃ 的报道基本没有。 故筛选一种能在高温下能正常生长代谢 的枯草芽孢杆菌， 在堆肥腐熟 的 运用具有重大意 义。 [0004]农业部于20 15年10月起禁止使用蛭弧菌微生态制剂， 故在水产弧菌病原菌的防治 上急需安全可靠的替代品。 而枯草芽孢杆菌在水产中的运用主要体现在水质调节方面， 在 抑菌水体病原菌的运用较少， 故筛选一种能有效抑制水产病原菌的枯草芽孢 杆菌具有重大 意义。 发明内容 [0005]本发明为了弥补现有枯草芽孢杆菌存在的不足之处， 从而提供了一种枯草芽孢杆 菌HY‑001， 该菌株具有能耐受高温培养、 抑制多株水产病原菌的能力， 将在堆肥腐熟及水产 养殖具有广泛的运用价 值。 [0006]本发明提供的枯草芽孢杆菌(Bacillus  subtilis)HY ‑001， 为广东省微生物菌种 保藏中心、 采购编号为GD MCC1.372的枯草芽孢杆菌， 经过紫外诱变、 50℃高温诱导及高产纤 维素酶、 淀粉酶一系列筛选获得， 保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)， 保藏编号为 CCTCC NO.M 2022622， 保藏日期为202 2年05月13日。 [0007]在对枯草芽孢杆菌HY ‑001的产酶能力对比试验中发现， 其产 纤维素酶、 淀粉酶的 酶活力高于枯草芽孢杆菌GDMCC1.372， 且在温度耐受方面也明显优于枯草芽孢杆菌 GDMCC1.372。 [0008]在对水产病原菌抑制试验检测中发现， 本发明的枯草芽孢杆菌HY ‑001对副溶血弧 菌、 溶藻弧菌、 铜 绿假单胞菌、 嗜水气单胞菌等水产病原菌上具有明显抑制效果， 其对水产 病原菌的抑制能力高于枯 草芽孢杆菌GDM CC1.372。 [0009]本发明的一株枯草芽孢杆菌菌粉的制备方法， 包括以下步骤： 将枯草芽孢杆菌HY ‑ 001摇瓶活化后接入10L种子罐， 装发酵液4L， 发酵结束后按4％接入200L发酵罐， 装发酵液 100L。 发酵温度40℃， 发酵25h， 搅拌150r/min， 溶氧80％。 发酵结束通过碟式离心机离心收 集菌泥后通过离心式喷雾干燥机喷雾制备成菌粉， 其中控制进风温度110℃， 出风温度70 ℃。说　明　书 1/7 页 3 CN 115109730 A 3