(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210689796.0 (22)申请日 2022.06.17 (83)生物保 藏信息 CCTCC NO:M202 2132 202 2.02.18 (71)申请人 武汉真福医药股份有限公司 地址 430206 湖北省武汉市东湖新 技术开 发区高新二路388号武汉光谷国际生 物医药企业加速 器17号楼1单 元5层 (72)发明人 王业富　董艳山　 (74)专利代理 机构 北京中济纬天专利代理有限 公司 11429 专利代理师 邓佳 (51)Int.Cl. C12N 9/68(2006.01) C12N 1/20(2006.01)A61K 38/48(2006.01) A61P 7/02(2006.01) A61P 39/06(2006.01) A61K 31/706(2006.01) C12R 1/125(2006.01) (54)发明名称 一种枯草芽孢杆菌纤溶酶及其制备方法和 抗氧化溶 血栓组合物 (57)摘要 本发明提出了一种枯草芽孢杆菌纤溶酶及 其制备方法和抗氧化溶血栓组合物， 属于枯草芽 孢 杆 菌 技 术 领 域 ，由 枯 草 芽 孢 杆 菌 Bacillussubtilis  ZF01发酵制得， 所述菌株保 藏于中国典型培养物保藏中心， 其保藏编号为 CCTCC NO:M 2022132。 本发明利用β ‑烟酰胺单 核苷酸与枯草杆菌纤溶酶组合物应用于角叉菜 胶诱导小鼠血栓模型试验证明， β ‑烟酰胺单核 苷酸具有抗氧化效果， 可降低角叉菜胶对血管的 氧化损伤程度， 缓解血栓形成。 同时枯草杆菌纤 溶酶也具有一定抗氧化水平， 并且 可以溶解因血 管氧化损伤而已经形成的血栓， 显著降低血栓积 累程度， 二者组合可协同作用于血管损伤诱发的 血栓， 且效果显著优于单一成分应用。 权利要求书1页 说明书5页 CN 115287278 A 2022.11.04 CN 115287278 A 1.一种枯草芽孢杆菌纤溶酶， 其特征在于， 由枯草芽孢杆菌B acillus subtilis  ZF01 发酵制得， 所述菌株保藏于中国典型培 养物保藏中心， 其保藏编号 为CCTCC NO:M 2022132。 2.根据权利要求1所述枯草芽孢杆菌纤溶酶， 其特征在于， 所述发酵包括固体发酵和液 体发酵， 发酵干燥后所 得枯草杆菌纤溶酶活性 不低于10 000FU/g。 3.一种如权利要求1或2所述枯草芽孢杆菌纤溶酶的制备方法， 其特征在于， 包括以下 步骤： (1)制备蛋白胨培 养基， 110‑120℃灭菌20 ‑40min， 备用； (2)将枯草芽孢杆菌Bacillus  subtilis  ZF01菌种按重量比2 ‑4％接种到蛋白胨培养 基中， 35‑38℃发酵18 ‑30h； (3)将发酵液经过离心、 微滤、 浓缩后喷雾干燥即得枯草芽孢杆菌纤溶酶， 枯草芽孢杆 菌纤溶酶活性＞10 000FU/g。 4.根据权利要求3所述的制备方法， 其特征在于， 所述蛋白胨培养基的成分与质量百分 比含量为： 蛋白胨2％、 葡萄糖3％、 磷酸氢二钠1％、 磷酸二氢钠0.1％、 硫酸镁0.05％、 无水 氯化钙0.02％、 消泡剂0.1％、 余 量为水。 5.根据权利要求3所述的制备 方法， 其特 征在于， 具体包括以下步骤： (1)制备蛋白胨培养基， 向培养基中加入以下质量百分比成分： 蛋白胨2％、 葡萄糖3％、 磷酸氢二钠1％、 磷酸二氢钠0.1％、 硫酸镁0.05％、 无水氯化钙0.02 ％、 消泡剂0.1％、 余量 为水， 115℃灭菌 30min， 备用； (2)将枯草芽孢杆菌Bacillus  subtilis  ZF01菌种按重量比3％接种到蛋白胨培养基 中， 37℃发酵24h； (3)将发酵液经过离心、 微滤、 浓缩后喷雾干燥即得枯草芽孢杆菌纤溶酶， 枯草芽孢杆 菌纤溶酶活性＞10 000FU/g。 6.一种抗氧化溶血栓组合物， 其特征在于， 由以下原料制备而成： β ‑烟酰胺单核苷酸和 权利要求1所述 枯草芽孢杆菌纤溶酶。 7.根据权利要求6所述抗氧化溶血栓组合物， 其特征在于， 由以下原料按质量百分比制 备而成： β ‑烟酰胺单核苷酸5 ‑20％、 权利要求1所述 枯草芽孢杆菌纤溶酶80 ‑95％。 8.根据权利要求5所述抗氧化溶血栓组合物， 其特征在于， 所述β ‑烟酰胺单核苷酸来源 于植物提取、 化学合成 或者生物酶催化。 9.一种如权利要求6 ‑8任一项所述的抗氧化溶血栓组合物在制备预防及治疗血管氧化 损伤、 血栓性疾病的食品、 保健食品和药品中的应用。 10.一种枯草芽孢杆菌Bacillus  subtilis  ZF01菌种， 其特征在于， 所述菌种保藏于中 国典型培 养物保藏中心， 其保藏编号 为CCTCC NO:M 2022132。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115287278 A 2一种枯草芽孢杆菌 纤溶酶及其制备方 法和抗氧化 溶血栓组 合物 技术领域 [0001]本发明涉及 枯草芽孢杆菌技术领域， 具体涉及一种枯草芽孢杆菌纤溶酶及其制备 方法和抗氧化溶 血栓组合物。 背景技术 [0002]β‑烟酰胺单核苷酸(β ‑烟酰胺单核苷酸)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的前体 物质。 NAD+在哺乳动物体内起到非常关键的作用。 其中最为人们所知的是抗衰老方面的研 究。 主要表现在调控能量代谢、 基因表达和修复。 此外， 研究证明通过口服β ‑烟酰胺单核苷 酸可增加NAD+含量， 促进血 管再生、 抗氧化、 抗炎症等功效。 [0003]枯草杆菌纤溶酶是由枯草芽孢杆菌发酵产生的一种丝氨酸蛋白酶， 具有口服溶解 血栓的功效， 在心血管疾病 领域具有非常广阔的应用价值。 其中被人们 所熟悉的是纳豆菌 发酵产生的纳豆 激酶， 纳豆 菌隶属于枯 草芽孢杆菌种， 纳豆亚种。 [0004]众所周知， 血栓性疾病是心 血管疾病最主要表 现， 是治病率和致死率最高的疾病。 其中脑卒中、 冠心病最为严峻。 而血栓性疾病的致病因素是各种内因和外因引起的血管壁 损伤导致血液凝血引起的。 而血管损伤便伴 随着内皮细胞氧化， 从而进一步加剧损伤和血 栓积累。 基于β ‑烟酰胺单核苷酸抗衰老抗氧化功效， 以及本公司枯草杆菌纤溶酶的纤溶作 用和溶栓功效。 通过两种成分的组合应用能够协同防治血栓性疾病， 一方面可以预防或延 缓血管壁氧化和损伤， 预防血栓形成； 另一方面还 可以溶解血管内已经形成的血栓， 达到溶 栓功效。 通过β ‑烟酰胺单核苷 酸和枯草杆菌纤溶酶的组合应用， 协同解决血栓性疾病， 既能 预防又能治疗。 对心血管疾病的防治具有重要的社会意义， 并且具备广阔的市场应用前景 和价值。 发明内容 [0005]本发明的目的在于提出一种枯草芽孢杆菌纤溶酶及其制备方法和抗氧化溶血栓 组合物， β ‑烟酰胺单核苷酸与枯草杆菌纤溶酶组合物可相互协同作用防控血栓性疾病， 一 方面抗氧化抗损伤， 预防血栓形成和积累； 另一方面同时还可以溶解已经形成的血栓， 达到 预防和治疗的双重目的并且安全无副作用。 [0006]本发明的技 术方案是这样实现的： [0007]本发明提供一种枯草芽孢杆菌纤溶酶， 由枯草芽孢 杆菌Bacillus  subtilis  ZF01 发酵制得， 所述菌株保藏于中国典型培 养物保藏中心， 其保藏编号 为CCTCC NO:M 2022132。 [0008]作为本发明的进一步改进， 所述发酵包括固体发酵和液体发酵， 发酵干燥后所得 枯草杆菌纤溶酶活性 不低于10 000FU/g。 [0009]本发明进一 步保护一种上述 枯草芽孢杆菌纤溶酶的制备 方法， 包括以下步骤： [0010](1)制备蛋白胨培 养基， 110‑120℃灭菌20 ‑40min， 备用； [0011](2)将枯草芽孢杆菌Bacillus  subtilis  ZF01菌种按重量比2 ‑4％接种到蛋白胨说　明　书 1/5 页 3 CN 115287278 A 3