(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211113530.8 (22)申请日 2022.09.14 (83)生物保 藏信息 CGMCC NO.25494 202 2.08.05 (71)申请人 东华大学 地址 200051 上海市长 宁区延安西路18 82 号 申请人 桂林电子科技大 学 (72)发明人 高品　唐正　孔一繁　张漓杉　 钟山　潘云飞　 (74)专利代理 机构 上海申汇 专利代理有限公司 31001 专利代理师 翁若莹 (51)Int.Cl. C12N 11/14(2006.01)C12N 1/20(2006.01) B09C 1/10(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种改性高岭土固定化芘降解菌剂的制备 方法与应用 (57)摘要 本发明公开了一种改性高岭土固定化芘降 解菌剂的制备方法： 将筛选获得的芘降解功能菌 株接种于LB液体培养基中， 置于恒温摇床中振荡 进行活化培养， 所得菌液经离心机离心后， 收集 底部菌体即得活化浓缩菌液； 将活化浓缩菌液和 酸改性高岭土依次加入到无菌LB液体培养基中 培养； 培养 结束后， 经离心机离心处理后， 收集底 部固体物进行冷冻干燥， 获得粉末状固定化菌 剂， 置于冰箱内保存， 即得改性高岭土固定化芘 降解菌剂。 本发 明制备的改性高岭土固定化芘降 解菌剂对多环芳烃污染土壤修复效果显著， 菌株 固定牢固， 且反应温和、 成本低廉、 无二次污染， 具有广阔的工程 化应用前 景。 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 CN 115505587 A 2022.12.23 CN 115505587 A 1.一种改性高岭土固定化 芘降解菌剂的制备 方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 步骤1)： 在高岭土中缓慢加入盐酸溶液并加热搅拌反应， 使用蒸馏水进行重悬洗脱并 离心回收， 重复洗脱和离心直至 洗脱液呈中性为止， 固体干燥后即得酸改性高岭土； 步骤2)： 将筛选获得的芘降解功能菌株接种于LB液体培养基中， 置于恒温摇床中振荡 进行活化培 养， 所得菌液经离心机 离心后， 弃去上清液， 收集底部 菌体即得活化浓 缩菌液； 步骤3)： 将步骤2)得到的活化浓缩菌液和步骤1)得到的酸改性 高岭土依次加入到无菌 LB液体培 养基中， 然后置 于恒温摇床内振荡进行培 养和结合反应； 步骤4)： 培养结束后， 经离心机离心处理后， 弃去上清液， 收集底部固体物进行冷冻干 燥， 获得粉末状固定化菌剂， 置 于冰箱内保存， 即得改性高岭土固定化 芘降解菌剂。 2.如权利要求1所述的改性高岭土 固定化芘降解菌剂的制备方法， 其特征在于， 所述步 骤1)中高岭土与盐酸溶 液的比例为1g:(8～10)mL， 盐酸浓度为3～5mo l/L。 3.如权利要求1所述的改性高岭土 固定化芘降解菌剂的制备方法， 其特征在于， 所述步 骤1)中加热的温度为6 0～80℃， 反应的时间为2 ～4h。 4.如权利要求1所述的改性高岭土 固定化芘降解菌剂的制备方法， 其特征在于， 所述步 骤2)中芘降解功能菌株为苍白杆菌， 分类名Ochrobactrum  sp.， 保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心， 保藏编号为CGMCC  NO.25494， 保藏地址： 北京市朝阳区北辰 西路1号院3号， 保藏日期： 202 2年08月0 5日。 5.如权利要求1所述的改性高岭土 固定化芘降解菌剂的制备方法， 其特征在于， 所述步 骤2)中活化培养的温度为37℃， 时间为1～2d； 离心机的转速为3000～5000r/min， 离心机的 温度为4～6℃， 离心时间为10～ 20min。 6.如权利要求1所述的改性高岭土 固定化芘降解菌剂的制备方法， 其特征在于， 所述步 骤3)中活化浓 缩菌液、 酸改性高岭土与无菌LB液体培 养基的质量比为1:20～40:25 0。 7.如权利要求1所述的改性高岭土 固定化芘降解菌剂的制备方法， 其特征在于， 所述步 骤3)中恒温摇床的控制温度为37℃， 振荡的速率 为150～200r/min， 时间为1～ 2d。 8.如权利要求1所述的改性高岭土 固定化芘降解菌剂的制备方法， 其特征在于， 所述步 骤4)中离心机的转速为4000～6000r/min， 离心机温度为4～6℃， 离心的时间为10～20min； 冷冻干燥的时间为12 ～24h， 冰箱的保存温度为 ‑20℃。 9.权利要求1～8任一项所述的制备 方法制备的改性高岭土固定化 芘降解菌剂。 10.权利要求9所述的改性高岭土固定化芘降解菌剂在修复多环芳烃污染土壤中的应 用。 11.如权利要求10所述的改性高岭土 固定化芘降解菌剂在修复多环芳烃污染土壤中的 应用， 其特征在于， 将所述改性高岭土固定化芘降解菌剂与多环芳烃污染土壤以质量比2～ 3:100充分混合。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115505587 A 2一种改性高岭土固定化 芘降解菌剂的制备方 法与应用 技术领域 [0001]本发明涉及 一种改性高岭土固定化芘降解菌剂的制备方法与应用， 属于污染土壤 微生物修复技 术领域。 背景技术 [0002]石油烃污染是当前土壤污染的重点问题， 石油烃具高毒性， 通过生物富集和食物 链传递的方式， 对人体健康构成威胁。 通常， 石油烃进入土壤环境后会破坏 土壤结构和微生 物群落组成， 造成土壤肥力下降。 其中高沸点组分可与土壤有机质结合， 并老化形成微生物 难以利用的结合态化合物， 可在土壤环境中长期稳定存在， 但也会随着环境条件(如pH和氧 化还原电位)的改变而重新释放， 对土壤生态系统造成影响。 石油烃对土壤生态系统具有毒 性效应， 导致微生物多样性和丰度降低， 影响土壤微生物对石油烃的降解效能。 芘是典型的 多环芳烃， 作为石油烃污染中难降解物质之一， 往往顽固存在于土壤环境中， 造成持久性的 危害。 [0003]在前期工作 中， 发明人从石油烃污染土壤中筛分获得一株芘降解功能菌株， 通过 16S rDNA测序和同源比对等分析， 鉴定为苍白杆菌(Ochrobactrum  anthropi)， GenBank登 录号为NR_0742 43.1。 通过 理化性质和降解特性分析发现， 该菌株能以芘为唯一碳源进行生 长繁殖， 对芘具有良好的代谢能力。 考虑到游离菌株在实际应用时易流 失， 且难以与土壤土 著微生物竞争等问题， 研发适合的固定化技术， 是保证功 能微生物 能够高效降解污染物的 关键。 将功能菌株与固定化载体混合后， 功能菌株可在固定化载体内部及表面附着生长， 一 方面能够降低外界环境对功能微生物的不利影响， 另一方面固定化材料能够富集土壤中的 污染物质， 增大降解微生物与污染物之 间的接触机率， 从而提高污染物降解效率。 高岭土是 一种粘土矿物， 具有良好的吸附性能与机械强度。 细菌微生物表面的羧基、 羟基、 磷酸基等 官能团， 可与粘土矿物表面的硅基、 羟基等活性位点 发生质子化或去质子化反应， 促使细菌 微生物与粘土矿物进行特异性吸附， 形成细菌微生物 ‑黏土矿物复合体。 然而， 常规高岭土 表面性质和化学反应性较差， 吸 附能力较弱， 难以与细菌微生物之间发生良好的特异性吸 附。 因此， 本方法通过盐酸对高岭土进行表面改性后作为负载 材料。 发明内容 [0004]本发明所要解决的技术问题是： 提供一种芘降解功能菌株固定化方法， 并用于联 合修复多环芳烃污染土壤。 [0005]为了解决上述技术问题， 本发明提供了一种改性高岭土固定化芘降解菌剂的制备 方法， 包括以下步骤： [0006]步骤1)： 在高岭土中缓慢加入盐酸溶液并加热搅拌反应， 使用蒸馏水进行重悬洗 脱并离心回收， 重复洗脱和离心直至 洗脱液呈中性为止， 固体干燥后即得酸改性高岭土； [0007]步骤2)： 将筛选获得的芘降解功能菌株接种于LB液体培养基中， 置于恒温摇床中 振荡进行活化培养， 所得菌液经离心机离心后， 弃去 上清液， 收集底部菌体即得 活化浓缩菌说　明　书 1/4 页 3 CN 115505587 A 3