(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221071249 2.1 (22)申请日 2022.06.22 (71)申请人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大 道1800号 (72)发明人 罗玮　杨强　 (74)专利代理 机构 苏州市中南伟业知识产权代 理事务所(普通 合伙) 32257 专利代理师 王玉仙 (51)Int.Cl. C12P 13/08(2006.01) C12N 1/38(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 一种提高大肠杆菌L-苏氨酸产量的方法 (57)摘要 本发明涉及一种提高大肠杆菌L ‑苏氨酸产 量的方法， 包括以下步骤： 发酵培养之前， 将大肠 杆菌活化后在种子培养基中培养得到种子液， 再 将种子液接种至发酵培养基中进行 发酵培养； 发 酵培养过程中， 发酵温度为35 ‑37℃， pH为6.8 ‑ 7.2， 发酵培养基的组成为： 20 ‑40g/L葡萄糖， 5 ‑ 15g/L硫酸铵， 0.3 ‑1g/L甜菜碱盐酸 盐， 0.5‑1g/L  MgSO4， 0.5‑1g/L KCl， 0.01 ‑0.1g/LMnSO4·H2O， 0.01‑0.1g/L FeSO4·7H2O， 9.8‑14.8g/L H3PO4。 本发明通过对代谢途径和生物标志物的分析， 对 大肠杆菌生产L ‑苏氨酸的发酵条件进行优化， 相 对于优化前产量 提高了82％， 且副产物少。 权利要求书1页 说明书9页 附图9页 CN 115029395 A 2022.09.09 CN 115029395 A 1.一种提高大肠杆菌L ‑苏氨酸产量的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 发酵培养之前， 将大肠杆菌活化后在种子培养基中培养得到种子液， 再将种子液接种 至发酵培 养基中进行发酵培 养； 发酵培养过程中， 发酵温度为35 ‑37℃， pH为6.8 ‑7.2， 发酵培养基的组成为： 20 ‑40g/L 葡萄糖， 5 ‑15g/L硫酸铵， 0.3 ‑1g/L甜菜碱盐酸盐， 0.5 ‑1g/L MgSO4， 0.5‑1g/L KCl， 0.01 ‑ 0.1g/L MnSO4·H2O， 0.01‑0.1g/L FeSO4·7H2O， 9.8‑14.8g/L H3PO4。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于： 所述发酵培养基中还包括甘氨酸和硝酸 钠。 3.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于： 所述甘氨酸的浓度为0.5 ‑1.5g/L， 硝酸钠 的浓度为0.5 ‑1.5g/L。 4.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于： 所述发酵培养基中还包括柠檬酸和谷氨酸 钠。 5.根据权利 要求4所述的方法， 其特征在于： 所述柠檬酸的浓度为5 ‑10g/L， 谷氨酸钠的 浓度为2‑5g/L。 6.根据权利要求1所述的方法， 其特 征在于： 所述大肠杆菌为大肠杆菌TWF0 01。 7.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述种子培养基组成为： 1 ‑5％蛋白胨、 0.5‑2％的酵母提取物、 1 ‑5％的氯化钠和2 ‑5％的琼脂粉， pH为6.8 ‑7.2。 8.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于： OD值达到0.5 ‑0.6时， 按接种量6％ ‑8％将 种子液接种至发酵培 养基中。 9.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于： 发酵培养过程中， 发酵初始碳氮比为6 ‑9: 1。 10.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于： 以葡萄糖为底物发酵生产L ‑苏氨酸， 底物 浓度为5‑20g/L。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115029395 A 2一种提高大肠杆菌L ‑苏氨酸产量的方 法 技术领域 [0001]本发明涉及生物技 术领域， 尤其涉及一种提高大肠杆菌L ‑苏氨酸产量的方法。 背景技术 [0002]苏氨酸是一种非常重要的发酵工业产品， 被广泛应用于食品添加剂、 饲料添加剂、 化妆品、 医药、 水产养殖和保健品等多个领域。 目前， 全球L ‑苏氨酸的需求量以每年超20％ 的增长率高速增长， 这主要是因为L ‑苏氨酸在饲料添加剂行业的需求量增长迅速。 近年来 的研究表明， 作为8种必需氨基酸之一， L ‑苏氨酸是猪饲料的第二限制氨基酸和家 禽饲料的 第三限制氨基酸。 虽然国内大宗氨基酸企业在国际市场占有主导地位， 但是我国氨基酸产 品研发能力弱， 菌种技术明显落后， 在产酸率和转化率等关键技术指标上比国外落后5％～ 10％， 生产成本明显高于 国外企业。 菌种生产性能的差距导致中国氨基酸工业在生产成本 上很难与国外企业 竞争。 [0003]专利CN201110279419.1公开了一种生产L ‑苏氨酸的方法， 将整个 发酵过程分为两 个阶段控制， 根据不同阶段的特点制 定相应的补料过程控制方案， 在菌株非生长阶段间歇 补料量或恒速补料率与产物生产强度有关， 生长阶段以菌株生长速率补加多种发酵成分， 实现补料过程的精确优化， 但以上精确控制方法过程繁琐， 难以满足工业化生产要求。 专利 CN201510199036.1公开了一种L ‑苏氨酸基因工程生产菌， 96孔板发酵L ‑苏氨酸产量最高达 15.12g/L； 专利CN201911368632.2公开了一种高转化率的L ‑苏氨酸的生产菌株及其构建方 法与应用， 在菌株ptsG处插入谷氨 酸棒杆菌来源的iolT， 失活PTS系统的同时引入谷氨 酸棒 杆菌中编码肌醇转移酶的iolT1/iolT2基因， L ‑苏氨酸产量最高达17.5g/L； 专利 CN200680021594.8公开了一种产生L ‑苏氨酸的方法， 发现合适地添加硫酸铵使初始硫含量 为0.35或更低时产率提高至43.6％。 专利CN201910077955.X公开了一株高产L ‑苏氨酸基因 工程菌， 以大肠杆菌TWF001为出发菌株， 缺失了位于基因组上的arcA、 iclR和tdcC。 但以上 方法若要满足工业 化生产的要求， 其 生产能力还有 待进一步提高。 发明内容 [0004]为解决上述技术问题， 本发明提供了一种提高大肠杆菌产L ‑苏氨酸的方法， 通过 在发酵培养基中添加不同的磷酸浓度、 代谢途径中的关键酶的激活剂 /抑制剂、 潜在的生物 标记物来实现。 [0005]本发明提供了一种提高大肠杆菌L ‑苏氨酸产量的方法， 包括以下步骤： [0006]发酵培养之前， 将大肠杆菌活化后在种子培养基中培养得到种子液， 再将种子液 接种至发酵培 养基中进行发酵培 养； [0007]发酵培养过程中， 发酵温度为35 ‑37℃， pH为6.8 ‑7.2， 发酵培养基的组成为： 20 ‑ 40g/L葡萄糖， 5 ‑15g/L硫酸铵， 0.3 ‑1g/L甜菜碱盐酸盐， 0.5 ‑1g/LMgSO4， 0.5‑1g/L KCl， 0.01‑0.1g/L MnSO4·H2O， 0.01‑0.1g/L FeSO4·7H2O， 9.8‑14.8g/L H3PO4。 [0008]进一步地， 所述发酵培 养基中还 包括甘氨酸和硝酸钠。说　明　书 1/9 页 3 CN 115029395 A 3