(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210676828.3 (22)申请日 2022.06.16 (71)申请人 漯河微康生物科技有限公司 地址 462007 河南省漯河市郾城区淞江路 西段方汇花园北邻 (72)发明人 方曙光　达旭阳　史祯晖　朱建国　 (74)专利代理 机构 北京海虹嘉诚知识产权代理 有限公司 1 1129 专利代理师 向群 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12N 1/04(2006.01) C12R 1/07(2006.01) (54)发明名称 一种提高凝结芽孢杆菌芽孢数和稳定性的 发酵方法和菌粉制备方法 (57)摘要 本发明“一种提高凝结芽孢杆菌芽孢数和稳 定性的发酵方法和菌粉制备方法 ”属于微生物发 酵工程技术领域。 所述一种提高凝结芽孢杆菌芽 孢数和稳定性的发酵方法包括： 种子罐发酵、 补 料分批发酵； 其特征在于， 种子罐发酵过程中的 DO维持大于30％； 所述补料分批发酵包括第一阶 段发酵和第二阶段发酵； 第一阶段 发酵过程中的 DO维持大于30％， 并在DO回升时启动补料； 第二 阶段发酵降低DO维持10 ‑20％； 所述DO回升指 1min内DO上升10％及以上。 本发明基于 所述发酵 方法还提供一种高芽孢数的凝结芽孢杆菌菌粉 制备方法， 本发明的发酵方法操作简单， 芽孢数 高， 可保存较长时间仍能保持较高的存活率， 稳 定性好。 权利要求书2页 说明书8页 CN 115261260 A 2022.11.01 CN 115261260 A 1.一种提高凝结芽孢杆菌芽孢数和稳定性的发酵方法， 包括： 种子罐发酵、 补料分批发 酵； 其特征在于， 种子罐发酵过程中的DO维持大于30％； 所述补料分批发酵包括第一阶段发 酵和第二阶段发酵； 第一阶段发酵过程中的DO维持大于30％， 并在DO回升时启动补料； 第二 阶段发酵降低DO维持10 ‑20％； 所述DO回升指1mi n内DO上升10％及以上。 2.根据权利要求1所述的一种提高凝结芽孢杆菌芽孢数和稳定性的发酵方法， 其特征 在于， 所述启动补料指添加补料培 养基； 和/或， 所述补 料培养基包括下述质量百分比的组分： 葡萄糖5 ‑6％， 酵母粉1.5 ‑2％， 硫 酸铵0.5‑1％， 其余为水。 3.根据权利要求1所述的一种提高凝结芽孢杆菌芽孢数和稳定性的发酵方法， 其特征 在于， 所述种子罐发酵的条件包括： 温度30 ‑45℃， 转速150 ‑500rpm， 通气量0.6 ‑1.0vvm， 罐 压0.03‑0.05Mpa、 pH5‑7、 时间为6 ‑12h； 和/或， 所述种子罐发酵的条件包括： 温度37 ‑42℃， 转速150 ‑500rpm， 通气量0.6 ‑ 1.0vvm， 罐压0.03‑0.05Mpa、 pH5.5‑6.0、 时间为6 ‑8h； 和/或， 所述种子罐发酵的培养基包括： 蛋白胨5 ‑25g/L， 牛肉浸粉5 ‑25g/L， 酵母粉3 ‑ 15g/L， 葡萄糖10 ‑30g/L， 氯化钠5 ‑20g/L， 磷酸氢二钾1 ‑5g/L， 硫酸镁0.2 ‑1g/L； 和/或， 所述种子罐发酵的培养基包括： 蛋白胨10g/L， 牛肉浸粉5g/L， 酵母粉3g/L， 葡萄 糖25g/L， 氯化钠5g/L， 磷酸氢二钾2g/L， 硫酸镁0.5g/L。 4.根据权利要求1所述的一种提高凝结芽孢杆菌芽孢数和稳定性的发酵方法， 其特征 在于， 所述补料分批发酵的第一阶段发酵的条件包括： 种子罐发酵产 物的接种量2 ‑10％， 培 养温度30‑45℃， pH 5‑7， 转速10 0‑200rpm， 通气量0.6 ‑1.2vvm， 罐压0.03‑0.05Mpa； 和/或， 所述第一阶段发酵的条件包括： 种子罐发酵产物的接种量5％， 培养温度37 ‑42 ℃， pH 5.5‑6.0， 转速10 0‑200rpm， 通气量0.6 ‑1.2vvm， 罐压0.05Mpa； 和/或， 所述第一阶段发酵的培养基包括： 蛋白胨5 ‑25g/L， 牛肉浸粉5 ‑25g/L， 酵母粉3 ‑ 15g/L， 葡萄糖10 ‑30g/L， 氯化钠5 ‑20g/L， 磷酸氢二钾1 ‑5g/L， 硫酸镁0.2‑1g/L， 硫酸锰0.2 ‑ 1g/L， 氯化钙0.2 ‑1g/L， 消泡剂0.0 5‑0.2％； 和/或， 所述第一阶段发酵的培养基包括： 蛋白胨15g/L， 牛肉浸粉5g/L， 酵母粉5g/L， 葡 萄糖25g/L， 氯化钠5g/L， 磷酸氢二钾4g/L， 硫酸镁0.5g/L， 硫酸锰0.5g/L， 氯化钙0.3g/L， 消 泡剂0.05％。 5.根据权利要求1或4所述的一种提高凝结芽孢杆菌芽孢数和稳定性的发酵方法， 其特 征在于， 所述补料分批发酵的第二阶段发酵的条件包括： 培养温度30 ‑45℃， pH5.5 ‑8.5， 转 速50‑100rpm， 通气量0.3 ‑0.6vvm， 罐压0.03‑0.05Mpa， DO维持10 ‑20％， 时间12 ‑24h； 和/或， 所述补料分批发酵的第二阶段发酵的条件包括： 培养温度37 ‑42℃， pH7.5 ‑8.5， 转速50‑100rpm， 通气量0.3 ‑0.6vvm， 罐压0.05Mpa， DO维持10 ‑20％， 时间16 h； 和/或， 所述补料分批发酵的第二阶段发酵结束后提高温度至60 ‑75℃， 维持10 ‑30min， 然后降温至25℃。 6.根据权利要求1所述的一种提高凝结芽孢杆菌芽孢数和稳定性的发酵方法， 其特征 在于， 还包括： 在进行种子罐发酵 前对菌株复壮、 菌株活化； 和/或， 所述菌株复壮 包括： 将冻存的菌株保存液 热处理后涂布于固体培 养基； 和/或， 所述菌株复壮包括： 挑取上述涂布了菌株保存液的固体培养基上的单菌落再进权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115261260 A 2行热处理并二次涂布固体培 养基； 和/或， 所述固体培 养基指营养琼脂 培养基； 和/或， 所述菌株活化包括： 将复壮的菌株的单菌落接种于营养琼脂培养基， 30 ‑45℃培 养18‑36h； 和/或， 所述营养琼脂培养基包括： 葡萄糖2g/L， 酵母浸粉5g/L， 蛋白胨10g/L， 琼脂15 ‑ 20g/L， pH7.0 ‑7.2。 7.根据权利要求6所述的一种提高凝结芽孢杆菌芽孢数和稳定性的发酵方法， 其特征 在于， 还包括： 在菌株复壮、 菌株活化后、 进行种子罐发酵 前进行摇瓶培 养； 和/或， 所述摇瓶培养包括： 将营养琼脂培养基上活化的菌株洗脱接种至摇瓶培养基中 振荡培养； 和/或， 所述摇瓶培养基包括： 蛋白胨10g/L， 牛肉浸粉5g/L， 酵母粉5g/L， 葡萄糖10g/L， 氯化钠5g/L； 和/或， 所述振荡培 养的条件 包括： 摇瓶 转速200r/min， 温度30‑45℃， 培养时间8‑12h； 和/或， 所述菌株为凝结芽孢杆菌菌株； 所述凝结芽孢杆菌菌株选自： 凝结芽孢杆菌 BC99菌株、 BC10 菌株、 BC3702菌株。 8.根据权利要求3所述的一种提高凝结芽孢杆菌芽孢数和稳定性的发酵方法， 其特征 在于， 所述种子罐发酵包括 一级种子罐发酵和二级种子罐发酵； 和/或， 所述一级种子罐发酵的接种量为5％， 发酵条件包括： 温度37 ‑42℃， 转速150 ‑ 500rpm， 通气量0.6 ‑1.0vvm， 罐压0.05Mpa， pH 5.5‑6.0， 培养时间8h； 和/或， 所述二级种子罐发酵的条件包括： 温度37 ‑42℃， 转速150 ‑300rpm， 通气量0.6 ‑ 1.0vvm， 罐压0.05Mpa， pH 5.5‑6.0， 培养时间6h； 和/或， 一级种子罐发酵结束后将一级种子罐的发酵液转移至二级种子罐中进行二级 种子罐发酵。 9.一种提高凝结芽孢杆菌芽孢数和稳定性的菌粉制备方法， 其特征在于， 包括权利要 求1‑7任一所述的一种提高凝结芽孢杆菌芽孢数和稳定性的发酵方法对凝结芽孢杆菌进 行 发酵。 10.根据权利要求9所述的一种提高凝结芽孢杆菌芽孢数和稳定性的菌粉制备方法， 其 特征在于， 还包括： 补料分批发酵结束后分离发酵液， 收集菌泥， 采用喷雾干燥方式获得菌 粉。 和/或， 所述分离发酵 液指： 用蝶式离心机分离发酵 液； 和/或， 所述喷雾 干燥的进风温度180 ‑220℃， 出风温度90 ‑100℃； 和/或， 所述凝结芽孢杆菌 选自： 凝结芽孢杆菌BC9 9菌株、 BC10 菌株、 BC3702菌株。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115261260 A 3