(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210641039.6 (22)申请日 2022.06.08 (71)申请人 艾美卫信生物药业 （浙江） 有限公司 地址 315600 浙江省宁波市宁海县科技工 业园区竹泉路2 9号 (72)发明人 马伟　朱楠　 (74)专利代理 机构 北京维正专利代理有限公司 11508 专利代理师 鲁勇杰 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12N 1/38(2006.01) C07K 14/34(2006.01) C12R 1/16(2006.01) (54)发明名称 一种提高CRM197蛋白产量的生长因子及其 制备方法和应用 (57)摘要 本申请涉及微生物培养技术领域， 具体涉及 一种提高CRM197蛋白产量的生长因子及其制备 方法和应用。 本申请的生长因子， 为一混合液， 每 升所述混合液包括以下重量的组分： 酵母浸粉/ 酵母浸膏10 ‑200g， 瓜氨酸0.1 ‑3g， 2‑80g含三价 铁离子的试剂。 该生长因子能使CRM197菌高效表 达， 便于较好地应用于CRM197菌发酵培养中以获 得高产量的CRM197蛋白。 权利要求书1页 说明书9页 CN 114806973 A 2022.07.29 CN 114806973 A 1.一种提高CRM197蛋白产量的生长因子， 其特征在于， 为一混合液， 每升所述混合液包 括以下重量的组分： 酵母浸粉/酵母浸膏10 ‑200g， 瓜氨酸0.1 ‑3g， 2‑80g含三价铁离子的试 剂。 2.根据权利要求1所述的生长因子， 其特征在于： 所述含三价铁离子的试剂为氯化铁、 硫酸铁、 硝酸铁及其水合物中的一种或多种的混合物。 3.根据权利要求2所述的生长因子， 其特征在于： 所述含三价铁离子的试剂包括硫酸铁 和硝酸铁， 所述硫酸铁和硝酸铁的重量比为1:3 。 4.根据权利要求1所述的生长因子， 其特征在于： 所述酵母浸粉/酵母浸膏与所述瓜氨 酸的重量比为10 0:1。 5.权利要求1 ‑4任一项所述的生长因子的制备 方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 取适量注射用水， 加入酵母浸粉/酵母浸膏10 ‑200g分散均匀后， 再加入瓜氨酸0.1 ‑3g 和含三价铁离子的试剂2 ‑80g充分溶解， 继续加入注射用水至接近1L， 调节pH至7.5 ±0.5， 继续加入注射用水定容至1L， 除菌过 滤或高压湿热灭菌后即收获所述 生长因子 。 6.权利要求1 ‑4任一项所述的生长因子在CRM197菌发酵培 养中的应用。 7.根据权利要求6所述的应用， 其特征在于： 所述生长因子适于CRM197菌在摇瓶培养 和/或种子罐培 养和/或生产罐培 养时添加。 8.根据权利要求7所述的应用， 其特征在于： CRM197菌开始摇瓶培养和/或种子罐培养 和/或生产罐培 养时， 按液体培 养基体积的0.01 ‑1%的添加量加入所述 生长因子 。 9.根据权利要求7所述的应用， 其特征在于： CRM197菌在摇瓶培养、 种子罐培养以及生 产罐培养时， 所述 生长因子的总添加量均≤ 5%。 10.根据权利要求7所述的应用， 其特征在于： CRM197菌进行生产罐培养过程中， 当OD600 达到15.0 ‑18.0时， 按液体培养基体积的0.01 ‑1%的添加量加入所述生长因子； 当OD600≥ 30.0时， 以每小时按液体培 养基体积的0.01 ‑0.02%的速率加入所述 生长因子 。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114806973 A 2一种提高 CRM197蛋白产量的生长因 子及其制备方 法和应用 技术领域 [0001]本申请涉及微生物培养技术领域， 更具体地说， 它涉及一种提高CRM197蛋白产量 的生长因子及其制备 方法和应用。 背景技术 [0002]白喉毒素是白喉棒杆菌(Corynebacterium  diphtheria)产生的蛋白质外毒素。 CRM197蛋白为白喉毒素的无毒形式， 由不产毒噬菌体β 197tox感染的白喉棒杆菌(CRM197 菌)产生， 其在丧 失酶活性及毒性的同时仍保留白喉毒 素的免疫原性， 是一种理想的多糖结 合疫苗载体蛋白。 [0003]现有制备CRM197蛋白的方法， 主要通过发酵培养CRM197菌， 从CRM197菌的培养物 纯化而得。 然而， 在实际发酵培养过程中， 无论CRM197菌的繁殖量过多或过少， 其生产收获 的CRM197蛋白产量均处于一个较低的水平。 因此， 如何有效提高CRM197菌的蛋白产量， 是目 前急需解决的技 术难题。 发明内容 [0004]为了有效提高C RM197菌的蛋白产量， 本申请 提供一种提高CRM197蛋白产量的生长 因子及其制备方法和应用， 该生长因子能使CRM197菌高效表达， 便于较好地应用于CRM197 菌发酵培 养中以获得高产量的CRM197蛋白。 [0005]第一方面， 本申请提供一种提高C RM197蛋白产量的生长因子， 为一混合液， 每升所 述混合液包括以下重量的组分： 酵母浸粉/酵母浸膏10 ‑200g， 瓜氨酸0.1 ‑3g， 2‑80g含三价 铁离子的试剂。 [0006]本申请的生长因子中， 酵母浸粉/酵母浸膏是以高蛋白酵母或啤酒酵母为原料， 经 自溶、 酶解、 浓缩等工艺制成， 富含蛋白质 、 氨基酸、 肽、 多肽、 核酸、 维生素及微量元素等营 养成分， 有助于 CRM197菌快速吸 收利用以表达分泌CRM197蛋白。 [0007]瓜氨酸是精氨酸生物合成的前体物质， 本申请使用瓜氨酸与酵母浸粉/酵母浸膏 合用能有效提高CRM197蛋白的产量， 这可能是由于瓜氨 酸能清除CRM197菌吸收营养物质时 产生的氨毒， 保证该蛋白的稳定存在于培养物中， 与此同时瓜氨酸还 能帮助CRM197菌产生 能量以大量表达分泌CRM197蛋白。 [0008]铁离子对大多数微生物的生长至关重要， 其作用于微生物体内酶的活力中心， 介 导氧化还原反应中动力学上自身难以发生的电子传递反应。 本申请的生长因子中添加含三 价铁离子的试剂， 其能为CRM197菌提供生长所需的铁离子， 保证CRM197菌的生命力。 此外， 本申请中含三价铁离子的试剂与瓜氨酸配伍， 能有效提高CRM197蛋白的产量， 这可能是由 于铁离子介导的电子传递反应能同步加快CRM197菌对瓜氨酸的利用。 [0009]因此， 本申请的生长因子中， 三种组分相辅相成， 能有效大量表达分泌CRM197蛋 白， 并保证该CRM197蛋白稳定存在于对应培养物 中， 由此能较好地应用于CRM197菌发酵培 养中以获得高产量的CRM197蛋白。 另外， 三种组分使用必须适量， 添加量过低起不到高效表说　明　书 1/9 页 3 CN 114806973 A 3