(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210687664.4 (22)申请日 2022.06.17 (71)申请人 南京农业大 学 地址 210095 江苏省南京市玄武区卫岗1号 (72)发明人 别小妹　张平　陆兆新　周立邦　 (74)专利代理 机构 南京天华专利代理有限责任 公司 32218 专利代理师 吴爽　徐冬涛 (51)Int.Cl. C07K 7/56(2006.01) C12P 21/04(2006.01) C12N 1/38(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12R 1/07(2006.01) C12R 1/125(2006.01) (54)发明名称 一种提高Baci llomycin D发酵产量的方法 (57)摘要 本发明提供了一种提高Bacillomycin  D发 酵产量的方法， 以枯草芽孢杆菌fmbJ为出发菌 株， 通过添加生长因子VC， 来提高Bacillomycin   D产量。 在本发明方法中， 在发酵培养基中添加 VC， 可提高Bacillomycin  D合成酶基因的相对表 达量， 促进氨基酸前体合 成途径中关键酶基因转 录， 促进了 degQ、comA、comP、comQ、sigM和spo0A 等参与次级代谢产物合成的正调控信号因子的 表达量上调， 同时下调了一些负调控因子如 rapC 和abrB， 使Bacillomycin  D的产量提升至对照组 的1.44倍； 同时本发明方法成本低、 操作简单方 便， 可以有效降低脂肽的生产成本、 提高生产效 率， 有望用于大规模生产应用。 权利要求书1页 说明书6页 附图3页 CN 115028686 A 2022.09.09 CN 115028686 A 1. 一种提高Bacillomycin  D发酵产量的方法， 其特征在于， 在发酵初期， 向发酵培养 基中转接产Baci llomycin D的芽孢杆菌种子液的同时， 添加生长因子VC， 发酵培 养即可。 2. 根据权利要求1所述的一种提高Bacillomycin  D发酵产量的方法， 其特征在于， 所 述的VC添加量 为0 g/L  ‑  0.75 g/L， 优选VC添加量 为0.6 g/L。 3. 根据权利要求1或2所述的一种提高Bacillomycin  D发酵产量的方法， 其特征在于， 所述芽孢杆菌为 枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌 。 4. 根据权利要求3所述的一种提高Bacillomycin  D发酵产量的方法， 其特征在于， 所 述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌 （Bacillus  subtilis） fmbJ， 由南京农业大学酶工程实验室自 主筛选所得， 菌种保藏 号为CGMCC No.0943。 5. 根据权利要求4所述的一种提高Bacillomycin  D发酵产量的方法， 其特征在于， 所 述方法包括如下 具体步骤： （1） 取枯 草芽孢杆菌fmbJ进行平板 培养； （2） 将步骤 （1） 中的枯草芽孢杆菌fmbJ转接至种子培养基中， 进行种子液培养， 种子液 培养条件为37℃， 180  rpm， 培养至OD600达0.8‑1.0； （3） 将步骤 （2） 中的种子液转接至发酵培养基中， 同时向发酵培养基中添加生长因子 VC， 进行发酵培 养制备抗菌 脂肽Bacillomycin D， 发酵条件为： 3 3℃， 180 rpm， 72‑150 h。 6. 根据权利要求5所述的一种提高Bacillomycin  D发酵产量的方法， 其特征在于， 所 述的种子培养基为： 牛肉浸膏3.0  g， 蛋白胨10.0  g， NaCl 5.0 g， 蒸馏水定容至1000  mL， pH  7.0‑7.2。 7. 根据权利要求5或6所述的一种提高Bacillomycin  D发酵产量的方法， 其特征在于， 所述的发酵培养基为： 葡萄糖  20.0 g， L‑谷氨酸 5.0 g， 酵母浸膏1.0  g， KH2PO4 0.5 g， MgSO4·7H2O 0.5 g， KCl 0.5 g， CuSO4·5H2O 0.15 mg， FeSO4·7H2O 1.2 mg， MnSO4 5mg， 蒸 馏水定容至10 00 mL， pH 7.0。 8. VC在提高抗菌 脂肽Bacillomycin D产量方面的应用。 9. 根据权利要求8所述的应用， VC的添加浓度为0  g/L‑0.75 g/L。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115028686 A 2一种提高Bacil lomycin D发酵产量的方 法 技术领域 [0001]本发明属于微 生物发酵 领域， 涉及一种提高Baci llomycinD发酵产量的方法。 背景技术 [0002]杆菌霉素D(Bacillomycin  D)属于伊枯草菌素(Iturin)家族， 是由枯草芽孢杆菌、 解淀粉芽孢杆菌等芽孢杆菌属微生物通过非核糖体途径合成的一类脂肽物质， 由脂质和肽 两部分构成， 脂质部分为β ‑氨基脂肪酸链(C11‑C17)， 肽段氨基酸序列为L ‑Asn、 D‑Tyr、 D‑ Asn、 L‑Pro、 L‑Glu、 D‑Ser和L‑Thr， 两部分通过苏氨酰 ‑β‑氨基键连接。 Bacillo mycin D对黄 曲霉菌、 赭曲霉菌、 匍枝根 酶菌等病原真菌具有很强的抑制效果， 有潜力成为高效安全的食 品防腐剂， 应用于食品和粮食的防腐。 [0003]然而， 利用基础发酵培养基对野生菌枯草芽胞杆菌(Bacillus  subtilis)进行发 酵， Bacillomycin  D产量较低。 研究人员对基础培养基进行优化， 以菊糖作为碳源， 能显著 提高Bacillomycin  D的产量， 分批补料发酵后产量更是提高了3.12倍， 但优化后的培养基 成本较高， 不利于推广Bacillomycin  D在防治粮食真菌污染等方面的应用； 另外， 如中国专 利申请第CN109 022474A和CN1091362 50A， 对参与Bacillomycin  D合成的信号因子进行过表 达， 也能显著提高其产量， 但是基因层面操作复杂。 [0004]检索暂未发现通过 添加生长因子VC提高Baci llomycin D产量的报道。 发明内容 [0005]针对现有技术的不足， 本发明的目的是提供一种提高Bacillomycin  D发酵产量的 方法。 本发明中Bacillomycin  D产量最低可以提高27％以上， 在最优VC添加量的情况下， 产 量可提高4 4％； 而且VC成本低廉、 容 易获取， 非常适用于大规模生产应用。 [0006]为实现上述目的， 本发明采用的技 术方案如下： [0007]一种提高Bacillomycin  D发酵产量的方法， 在发酵初期， 向发酵培养基中转接产 Bacillomycin D的芽孢杆菌种子液的同时， 添加生长因子VC， 即可。 [0008]该方法中， 本发明生长因子VC的添加促进了Bacillomycin  D合成酶表达基因的上 调， 同时也促进了一些参与次级代谢产物合成的信号因子的表达量上调， 使得 Bacillomycin D的产量得以提高。 [0009]优选的， 所述的VC添加量 为0g/L‑0.75g/L， 更优选VC添加量 为0.6g/L。 [0010]当VC添加量 为0.6g/L时， Baci llomycin D的产量可以提升 至对照组的1.4 4倍。 [0011]优选的， 所述芽孢杆菌为 枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌 。 [0012]更优选的， 所述芽孢 杆菌为枯草芽孢 杆菌(Bacillus  subtilis)fmbJ， 由南 京农业 大学酶工程实验室自主筛 选所得， 菌种保藏 号为CGMCC No.0943。 [0013]其中， 因鉴定技术的进步， 枯草芽孢 杆菌(Bacillus  subtilis)fmbJ后更名为解淀 粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)fmbJ， 因此在本申请中， 无论是枯草芽孢杆菌fmbJ还是 解淀粉芽孢杆菌fmbJ， 都 实为保藏 号CGMCC No.0943的这株菌 。说　明　书 1/6 页 3 CN 115028686 A 3