(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210750591.9 (22)申请日 2022.06.28 (83)生物保 藏信息 CCTCC NO:M2021 1637 2021.12.17 (71)申请人 广东海洋大学 地址 524000 广东省湛江市麻章区海大路1 号 (72)发明人 李昆太　彭帅英　凌晓宁　谭明辉　 张俊　 (74)专利代理 机构 南昌贤达专利代理事务所 (普通合伙) 36136 专利代理师 潘金凤 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12N 1/02(2006.01)C12N 1/04(2006.01) A23B 7/155(2006.01) C12R 1/07(2006.01) (54)发明名称 一种拮抗柑橘绿霉病致病菌指状青霉的海 洋微生物及其筛 选方法与应用 (57)摘要 本发明公开了一种拮抗柑橘绿霉病致病菌 指状青霉的海洋微生物及其筛选方法与应用， 具 体地是从海洋淤泥中筛选到一株对指状青霉具 有较好拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌HY  2‑1 (Bacillus  amyloliquefaciens  HY 2‑1)， 该菌 株分离自广东省湛江市北部湾海域的海底淤泥， 源于生境相对 特殊的海洋环境， 其生长特性表现 出良好的盐耐受性； 该菌株可产表 面活性素和丰 原素等脂肽类活性化合物； 该菌株发酵上清液对 指状青霉具有明显的拮抗作用， 而且能够有效降 低柑橘的失重率和腐烂率， 减缓柑橘中可溶性固 形物、 可滴定酸、 抗坏血酸、 总糖的分解， 从而减 缓柑橘果实营养的流失。 可见该菌株不仅可以丰 富柑橘绿霉病拮抗微生物资源的来源， 也可为开 发成柑橘保鲜剂奠定 基础。 权利要求书1页 说明书11页 序列表1页 附图5页 CN 115094002 A 2022.09.23 CN 115094002 A 1.一种海洋微生物， 其特征在于， 命名为解淀粉芽孢杆菌HY2 ‑1(Bacillus   amyloliquefaciens  HY2‑1)， 保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为CCTCC  NO： M20211637。 2.根据权利要求1所述的海洋微 生物， 其特 征在于， 其基因序列如SEQ  ID NO.1所示。 3.根据权利要求1所述的一种海洋微 生物， 其特 征在于， 从海底淤泥中分离 筛选得到。 4.一种海洋微 生物的筛 选方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 步骤一： 将海底淤泥加入无菌水中， 混合均匀梯度稀释到10‑4， 吸取10‑3、 10‑4稀释液分 别涂布在改良LB固体培养基、 高氏一号培养基的平板上， 培养至菌落出现并计数， 挑取单菌 落进行划线纯化， 将纯化的单菌落接种到改良LB液体培养基中培养， 所得菌液冷冻保存， 获 得菌株； 步骤二： 采用平板对峙法， 将步骤一中所得的菌株， 分别接种于装有改良LB液体培养基 的锥形瓶中， 活化， 分别取活化后的菌液， 涂布于改良LB固体培养基中， 获得单菌落， 将单菌 落分别点接于含指 状青霉孢子悬液的PDA培养基中， 培养， 初筛获得对指 状青霉具有拮抗效 果的海洋细菌； 步骤三： 将初筛获得的具有拮抗指状青霉效果的海洋细菌分别接种于改良LB液体培养 基中， 活化， 将活化后的菌液按规定的接种量接种于发酵培养基中， 继续培养， 取发酵液于 高速离心， 无菌过滤， 得无菌的发酵上清液， 利用牛津杯法检测发酵上清液的抑菌效果， 筛 选得到解淀粉芽孢杆菌 HY2‑1。 5.根据权利要求4所述的一种海洋微生物的筛选方法， 其特征在于， 所述改良LB液体培 养基包括： 蛋白胨， 酵母浸粉， MgCl2， MgSO4， KCl， CaCl2， NaCl， 蒸馏水， pH  7.0， 其中所述改良 LB固体培 养基在所述改良LB液体培 养基基础上添加20g琼脂， 121℃灭菌20mi n。 6.根据权利要求4所述的一种 海洋微生物的筛选方法， 其特征在于， 所述高氏一号培养 基包括： 可溶性淀粉、 KNO3、 K2HPO4、 FeSO4、 MgCl2， MgSO4， KCl， CaCl2， NaCl， 琼脂， 蒸馏水， pH   7.2， 121℃灭菌20min； 所述PDA培养基包括： 去皮土豆， 葡萄糖， 蒸馏水， 其中固体培养基添 加琼脂20g， 121℃灭菌20mi n。 7.根据权利要求4所述的一种 海洋微生物的筛选方法， 其特征在于， 所述发酵培养基包 括： 葡萄糖， 蔗糖， 蛋白胨， 硫酸铵， 磷酸二氢钾， 硫酸镁， 硫酸锰， 硫酸锌， 蒸馏水， pH  7.0‑ 7.2， 115℃灭菌 30min。 8.一种如权利要求1 ‑3任一所述的海洋微生物或如权利要求4 ‑7任一所述筛选方法得 到的海洋微 生物在拮抗柑橘绿霉病上应用。 9.根据权利要求8所述的应用， 其特 征在于， 所述柑橘绿霉病的致病菌为指状 青霉。 10.一种如权利要求1 ‑3任一所述的海洋微生物或如权利要求4 ‑7任一所述筛选方法得 到的海洋微 生物在柑橘保鲜剂上的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115094002 A 2一种拮抗柑橘绿霉病致病菌指状青霉的海洋微生物及其筛选 方法与应用 技术领域 [0001]本发明涉及菌株分离技术领域， 具体是一种拮抗柑橘绿霉病致病菌指状青霉的海 洋微生物及其筛 选方法与应用。 背景技术 [0002]柑橘类水果风味独特， 果实含有大量维生素C、 类胡萝卜素、 果胶等生物活性物质， 深受消费者的喜爱。 由于柑橘营养成分丰富， 在柑橘采摘、 运输及储存过程中， 容易受到病 原体的感染， 其中由指状青霉(Penicillium  digitatum)引起的绿霉病是采后柑橘最具破 坏性的病害， 占柑橘储藏过程因真菌性病害造成腐烂损失的60 ‑80％。 目前， 对于柑橘绿霉 病的防治主要采用化学杀菌剂如抑霉唑、 噻苯咪唑、 咪鲜胺 等， 但这些化学农药的过渡使用 往往容易导致病原真菌的耐药性， 且对人体健康存在一定的风险， 因此寻求绿色安全可靠 的生物防治方法成为了研究者们的关注热点。 [0003]对柑橘绿霉病的生物防治方法主要包括使用植物提取物、 抗菌肽及拮抗微生物 等， 其中以使用拮抗微生物的方法研究最多。 开展柑橘绿霉病微生物防治的首要工作是获 得对病原真菌具有拮抗活性且能适应柑橘贮藏运输环境的拮抗微生物。 近年来， 已从陆地 环境如根际土壤、 柑橘 果实和叶片等处分离出大量拮抗柑橘绿霉病菌的微生物， 主要为细 菌、 酵母菌和放线菌。 由于对陆地资源进 行了广泛的微生物筛选和研究， 发现新的微生物变 得越来越困难。 海洋蕴含着 丰富的微生物资源， 海洋微生物生活在高盐、 低温、 无光照、 寡营 养等极端环境中， 这些环境决定了其与陆地微生物生长代谢 的差别， 使得其具有产生独特 生物活性化合物的潜力。 海洋微生物已被证实是生物活性化合物的重要来源， 其代谢产物 具有多种药理 活性， 包括 抗癌、 抗菌、 抗肿瘤等， 被喻为 生产天然产物的微 生物工厂。 [0004]目前， 对于柑橘 绿霉病菌具有拮抗作用的菌株大多筛选自陆地环境， 鲜有从海洋 环境中筛选拮抗菌株的报道。 海洋与陆地有较大的环境差别， 演化出了独特的代谢能力， 因 此从海洋中有望 筛选到抑菌活性物质结构或功能相对新颖的拮抗菌株。 发明内容 [0005]本发明的目的在于至少解决现有技术中存在的技术问题之一， 提供一种拮抗柑橘 绿霉病致病菌指状 青霉的海洋微 生物及其筛 选方法与应用。 [0006]本发明的技 术解决方案如下： [0007]一种海洋微生物， 命名为解淀粉芽孢杆菌HY2 ‑1(Bacillus  amyloliquefaciens   HY2‑1)， 于2021年12月17日保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为CCTCC  NO： M20211637。 [0008]进一步地， 其基因序列如SEQ  ID NO.1所示。 [0009]进一步地， 从海底淤泥中分离 筛选得到。 [0010]本发明还公开了一种海洋微 生物的筛 选方法， 包括以下步骤：说　明　书 1/11 页 3 CN 115094002 A 3