(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210684914.9 (22)申请日 2022.06.14 (83)生物保 藏信息 CCTCC NO： M 202 2665 2022.05.19 (71)申请人 中国科学院青岛生物能源与过程研 究所 地址 266000 山东省青岛市崂山区松岭路 189号 (72)发明人 刘亚君　陈朝阳　崔球　 (74)专利代理 机构 山东康裕律师事务所 3731 1 专利代理师 傅培 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12P 7/16(2006.01) C12R 1/145(2006.01) (54)发明名称 一种拜氏梭菌及其 生产丁醇的方法 (57)摘要 本发明提供了一种可高产丁醇的拜氏梭菌 （Clostridium  beijerinckii ） MT1106， 保藏于中 国典型培养物保藏中心 （CCTCC） ， 其保藏编号为 CCTCC NO： M 2022665， 保藏日期2022年5月19日。 所述菌株MT1106具有抗逆性高的特点， 在pH= 5.5‑7.5的较宽pH条件和25 ‑37℃的温度条件下 均能获得较高的生物量和丁醇产量。 此外， 通过 在发酵体系中添加铁离子， 可以进一步大幅提升 丁醇产量， 使得丁醇产量超过23  g/L， 丁醇与丙 酮的总产量超过2 5 g/L。 本申请 还提供了与纤维 素降解高温菌热纤梭菌以木质纤维素为底物联 合发酵生产丁醇的方法。 由于拜氏梭菌MT1106的 最适pH与热纤梭菌发酵 获得的糖液一致， 因此无 需额外调节pH、 且不需添加成本较高的营养成 分， 即可直接用于MT1106的发酵， 从而极大降低 了生产成本， 具有重要的实际应用价 值。 权利要求书1页 说明书5页 CN 115058361 A 2022.09.16 CN 115058361 A 1.一株产丁醇的拜氏梭菌株， 其特征在于： 所述拜氏梭菌株命名为拜氏梭菌MT1106 （Clostridium  beijerinckii ） ， 保藏于中国典型培养物保藏中心 （CCTCC） ， 其保藏编号为   CCTCC NO： M 2022665， 保藏日期202 2年5月19日。 2.一种包 含权利要求  1 所述的拜氏梭菌株MT1 106的菌剂。 3.如权利要求1所述的拜氏梭菌株的应用， 其特征在于： 将所述的拜氏梭菌株用于发酵 生产丁醇。 4.根据权利要求3所述的拜氏梭菌株的应用， 其特征在于： 将权利要求1所述的拜氏梭 菌株接入发酵培养基进 行发酵生长， 发酵完成后， 从发酵液中分离得到丁醇； 所述 发酵培养 基中的碳源为葡萄糖、 木糖、 果糖、 蔗糖和纤维二糖中一种或者多种的组合； 所述发酵培养 基中有含铁化 合物。 5.根据权利 要求4所述的拜氏梭菌株的应用， 其特征在于： 所述拜氏梭菌MT1106的接种 量为体积比1 ‑10%； 所述发酵培养基中的碳源浓度为30 ‑100g/L， 含铁化合物的含量为0.1 ‑ 4.0 g/L； 所述的发酵生长的温度为25 ‑37℃； 所述发酵生长的初始pH为5.5 ‑7.5。 6.根据权利要求5所述的拜氏梭菌株的应用， 其特征在于： 所述发酵培养基中的碳源为 葡萄糖； 所述含铁化 合物为硫酸铁或者硫酸 亚铁。 7.根据权利要求4 ‑6中任意一项所述的拜氏梭菌株的应用， 其特征在于： 所述的葡萄糖 为木质纤维素糖化后获得的含有葡萄糖的糖液； 所述发酵培养基的组份为： 碳源30 ‑100g/ L， 含铁化合物0.1 ‑4.0 g/L， 碳酸氢钠2.5  g/L， 酵母提取物10  g/L， 硫化钠0.05  g/L， 氯化 钠1 g/L， 六水合氯化镁  0.5 g/L， 磷酸二氢钾0.2  g/L， 氯化铵0.3  g/L， 氯化钾0.3  g/L， 二 水合氯化钙0.015  g/L， 六水合氯化钴0.2  mg/L， 四水合氯化锰0.1  mg/L， 氯化锌0.07  mg/ L， 硼酸0.006  mg/L， 二水合钼酸钠0.03  mg/L， 六水合氯化镍0.02  mg/L， 二水合氯化铜 0.002 mg/L。 8.根据权利 要求3所述的拜氏梭菌株的应用， 其特征在于： 将所述拜氏梭菌MT1106与热 纤梭菌偶联生产丁醇， 具体包括以下步骤： （1） 木质纤维素糖化： 向发酵罐中添加糖化培养基和预处理后的木质纤维素底物， 混合 均匀； 接种热纤梭菌 菌株进行糖化， 得到 木质纤维素发酵 液； （2） 发酵生产 丁醇： 在pH=5.5 ‑7.5的条件下， 向步骤 （1） 得到的木质纤维素发酵液中， 按 照体积比1 ‑10%接种拜氏梭菌MT1106， 加入含铁化合物0.1 ‑4.0 g/L和微量金属盐； 发酵 1‑6 天或当木质纤维素发酵 液中葡萄糖浓度为 零时， 结束发酵， 得到丁醇。 9.根据权利要求8所述的拜氏梭菌株的应用， 其特征在于： 步骤 （2） 所述发酵生产丁醇 的温度为30 ‑35℃， 所述含铁化合物为硫酸铁或硫酸亚铁， 所述微量金属盐具体为： 每升含 六水合氯化钴0.2  mg， 四水合氯化锰0.1  mg， 氯化锌0.07  mg， 硼酸0.006  mg， 二水合钼酸钠 0.03 mg， 六水合氯化镍 0.02 mg， 二水合氯化铜0.0 02 mg。 10.根据权利要求8或9所述的拜氏梭菌株的应用， 其特征在于： 步骤 （1） 所述的木质纤 维素底物为秸秆或木糖渣， 所述糖化温度为55 ‑65℃； 所述的糖化培养基的组份为： 磷酸氢 二钾0.6 g/L、 磷酸二氢钾0.3  g/L、 硫酸铵1.1  g/L、 氯化钙0.1  g/L、 氯化镁0.5  g/L、 硫酸 亚铁0.5 mg/L、 硫化钠0.2  g/L、 玉米浆5.0  g/L， pH 7.5； 所述热纤梭菌的接种比例为5 ‑ 10%。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115058361 A 2一种拜氏梭菌及其生产丁 醇的方法 技术领域 [0001]本发明属于生物学领域， 具体涉及一株可以 用于生产丁醇的拜式梭菌 Clostridium  beijerinckii  MT1106， 以及采用所述菌株偶联热纤梭菌， 以木质纤维素为底 物生产丁醇的方法。 背景技术 [0002]生物丁醇是一种可持续的新型生物燃料， 与生物乙醇相比， 其能量值更高， 吸湿性 和腐蚀性更小， 且与现有的油气管道和汽车发动机更兼容， 因此被看作是替代化石燃料 的 最佳选择之一。 生物 丁醇通常是通过丙酮 ‑丁醇‑乙醇(ABE)发酵途径， 由产溶剂梭状芽孢杆 菌产生。 丙酮丁酸梭菌(Clostridium  acetobutylicum)是工业上最常用的产生物丁 醇的微 生物， 它可以将单糖或寡糖转化为丙酮、 丁醇和乙醇等生物产品， 并伴随着少量乙酸和丁酸 的产生； 其中， 发酵产物中丙酮 ‑丁醇‑乙醇(ABE)的比例一般接近3:6:1。 除了丙酮丁酸梭 菌， 能够用于或潜在的可用于工业发酵生产生物丁醇的梭状芽胞杆菌主要有： 乙酰丁酸梭 菌(Clostridium  acetobutylicum)、 拜氏梭菌(Clostridium  beijerinckii)、 嗜糖双丁酸 梭菌(Clostridium  sacharoperbutylacetonicum)和嗜糖丁酸梭菌(Clostridium   saccharobutyl icum)等。 [0003]目前， 发酵生产生物丁醇的技术面临着原料成本高、 丁醇产率低以及过多的副产 物产生等问题。 这主要是由于丁醇对菌体具有毒害作用， 从而影响了产量和产率。 目前， 野 生型梭菌的丁醇产量通常不超过14g/L， 基因工程菌则不超过21g/L。 此外， 除发酵产物的终 浓度低外， 丁醇在总产 物中的比例也较低， 一般只占了60％， 其余30％为丙酮， 10％为乙醇。 在这二者的叠加影响下， 丁醇回收、 分离、 蒸馏消耗的设备和能源成本高， 从而增加了发酵 生产丁醇的成本。 此外， 传统的丁醇发酵普遍采用淀粉来源的葡萄糖为碳源进 行生产， 存在 成本受粮食价格波动以及与人争粮、 与粮争地的问题。 随着粮食价格的上涨及世界粮食资 源的匮乏， 丁醇的发展必将处于 劣势。 众所周知， 世界上储量最大的潜在碳源是木质纤维素 生物质， 因此， 如果能够实现木质纤维素到丁醇的生产， 则从根本上解决了丁醇生产中碳源 成本高的问题。 [0004]目前， 研究人员已经开发了木质纤维素原料到糖 的转化方法， 以实现非粮原料对 淀粉糖的替代， 但主要利用真菌来源的商业化纤维素酶、 半纤维素酶将预处理的农业秸秆 等木质纤维素原料进 行水解， 获得含糖水解液， 再以水解液作为糖源进 行下游发酵培养。 例 如， 发明专利201610193266.1、 201210197741.4、 201710808876.2、 201210089406.2等均先 采用真菌来源的商业化酶制剂将木质纤维素底物水解成糖后再发酵产丁醇。 然而， 采用真 菌来源的酶制剂成本高昂， 使得木质纤维素来源的可发酵糖不具有与淀粉糖相比的市场竞 争力， 进而导致木质纤维素生产丁醇的发酵技术难以真正实现应用。 发明人前期提出了不 依赖于游离酶的木质纤维素生物糖化技术， 主要利用热纤梭菌等高温纤维素降解菌为全菌 催化剂， 并利用该技术与下游发酵技术配合实现木质纤维素到葡萄糖酸钠、 油脂类、 色