(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210640288.3 (22)申请日 2022.06.08 (83)生物保 藏信息 GDMCC 1.2948 2021.12.01 (71)申请人 中国科学院西北生态 环境资源研究 院 地址 730000 甘肃省兰州市城关区东岗西 路318号 (72)发明人 于雪　张威　章高森　刘光琇　 陈拓　吴玉洁　 (74)专利代理 机构 兰州中科华西专利代理有限 公司 620 02 专利代理师 曹向东 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01)C12P 23/00(2006.01) C07C 403/24(2006.01) C12R 1/06(2006.01) (54)发明名称 一种抗氧化节杆菌及其次级代谢产物的制 备和应用 (57)摘要 本发明涉及一种抗氧化节杆菌， 该节杆菌来 源于珠穆朗玛峰北坡东绒布冰川土壤， 其分类命 名为抗氧化节杆菌 （ Arthrobacter  sp.QL17） ， 在 广东省微生物菌种保藏中心的保藏编号为 GDMCC  1.2948。 同时， 本发明还公开了该抗氧化节杆菌 的次级代谢产物及其制备和应用。 本发明首次公 开了抗氧化节杆菌的次级代谢产物art hroxanthin 的制备方法及该类胡萝卜素的清 除DPPH自由基 能力， 对后续arthroxanthin的工业开发都具有 重大意义。 权利要求书2页 说明书5页 附图6页 CN 115093991 A 2022.09.23 CN 115093991 A 1.一种抗氧化节杆菌， 其特征在于： 该节杆菌来源于珠穆朗玛峰北坡东绒布冰川土壤， 其分类命名为抗氧化节杆菌 （ Arthrobacter  sp. QL17） ， 在广东省微生物菌种保藏中心的 保藏编号 为GDMCC 1.2948。 2.如权利要求1所述的一种抗氧化节杆菌的次级代谢产物， 其特征在于： 该次级代谢产 物为类胡萝卜素 （ar throxanthi n） ， 其结构式如下： 。 3.如权利要求2所述的一种抗氧化节杆菌的次级代谢产物的制备 方法， 包括以下步骤： ⑴固体培养： 将在‑80℃冰箱中保存的抗氧化节杆菌QL17涂布于R2A琼脂平板培养基上， 于15℃培养 箱中培养5d， 得到平板 菌种； ⑵种子培养： 取生长良好的平板菌种， 接种于装液量为30%的R2A液体培养基中， 在15℃、 160rpm的条 件下培养72h， 得到种子液； ⑶发酵培养： 取生长良好的种子液， 按体积分数5%的接种量接种于装液量为30%的R2A液体培养基 中， 于15℃、 16 0rpm的条件下培 养3d， 得到菌体； ⑷菌体的前处 理： 将菌体加到其5倍体积量的100%甲醇中进行萃取， 萃取次数为2次， 直至菌体变为无色； 合并两次萃 取所得， 得到类胡 萝卜素萃 取液； 所述类胡 萝卜素萃 取液经旋转蒸发至干、 甲醇 复溶， 得到类胡萝卜素粗 提物； ⑸正向硅胶柱分离： 所述类胡萝卜素粗提物采用干法拌样， 在正向硅胶柱上分离纯化， 采用石油醚装柱， 上 样后氯仿 ‑丙酮梯度混合物洗脱， 得到A~D四个馏分； 其中A馏分体积比为5:1的氯仿和丙酮， B馏分体积比为3:1的氯仿和丙酮， C馏分体积比为1:1的氯仿和丙酮， D为甲醇洗脱； ⑹Sephadex LH‑20 分子筛分离： 在体积比为1:1的CHCl3和MeOH构成的流动相中， 将所述步骤 ⑸所得的馏分C在Sephadex   LH‑20 分子筛上反复纯化和分离， 共得到14个馏分， 其中红色液体确定为馏分C12； ⑺半制备型高效液相色谱分离： 将所述馏分C12用半制备型高效液相色谱C18  柱纯化， 即得次级代谢产物类胡萝卜素 纯品。 4.如权利要求3所述的一种抗氧化节杆菌的次级代谢产物的制备方法， 其特征在于： 所 述步骤⑴中R2A琼脂平板培养基是指将酵母浸出粉0.5g、 蛋白胨0.5g、 酪蛋白水解物0.5g、 葡萄糖0.5g、 可溶性淀粉0.5g、 磷酸氢二钾0.3 g、 无水硫酸镁0.024g、 丙酮酸钠0.3g、 20g琼 脂与1L纯 水混合均匀后， 即得。 5.如权利要求3所述的一种抗氧化节杆菌的次级代谢产物的制备方法， 其特征在于： 所 述步骤⑵和所述步骤 ⑶中R2A液体培养基是指将酵母浸 出粉0.5g、 蛋白胨0.5g、 酪蛋白水解权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115093991 A 2物0.5g、 葡萄糖0.5g、 可溶性淀粉0.5g、 磷酸氢二钾0.3g、 无水硫酸镁0.024g、 丙酮酸钠0.3g 与1L纯水混合均匀后， 即得。 6.如权利要求3所述的一种抗氧化节杆菌的次级代谢产物的制备方法， 其特征在于： 所 述步骤⑸中正向硅胶柱分离的条件 是指正向硅胶柱的尺 寸为5 cm  × 60 cm， 填充高度  40  cm， 硅胶粒径为10 0~200目。 7.如权利要求3所述的一种抗氧化节杆菌的次级代谢产物的制备方法， 其特征在于： 所 述步骤⑸中梯度洗脱的氯仿 ‑丙酮的体积比依次为5:1,  3:1, 1:1。 8.如权利要求3所述的一种抗氧化节杆菌的次级代谢产物的制备方法， 其特征在于： 所 述步骤⑺中C18 柱的尺寸 为10 mm  ×  250 mm, 填充高度 250 mm。 9.如权利要求3所述的一种抗氧化节杆菌的次级代谢产物的制备方法， 其特征在于： 所 述步骤⑺中半制备型高效液相色谱分离的条件是指流动相由体积比为9:1的MeOH和H2O构 成； 进样前基线稳定10min后进样， 每次进样1ml； 检测器波长为254nm， 流动相流速为2.0   ml/min； 收集含新型类胡萝卜素 纯品的的出峰时间为34mi n。 10.如权利要求2所述的一种抗氧化节杆菌的次级代谢产物在抗氧化方面的应用， 其特 征在于： 该次级代谢产物对二苯基苦基苯肼自由基具有抑制作用， 其半抑制浓度IC50为 69.82  µg/mL。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115093991 A 3