(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210656514.7 (22)申请日 2022.06.11 (83)生物保 藏信息 CGMCC NO.22542 2021.0 5.17 CGMCC NO.22541 2021.0 5.17 (71)申请人 青岛科技大 学 地址 266000 山东省青岛市崂山区松岭路 99号 申请人 青岛金朝日农业科技发展 有限公司 (72)发明人 刘全兰　韩燕红　安玉良　吕鑫　 陈旺　王宇慧　刘全海　 (74)专利代理 机构 青岛中天汇智知识产权代理 有限公司 37241 专利代理师 李浩(51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) A01N 63/23(2020.01) A01N 63/20(2020.01) A01P 1/00(2006.01) A01P 7/04(2006.01) A01P 21/00(2006.01) A01H 4/00(2006.01) A01G 22/25(2018.01) C12R 1/07(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种微生物菌剂 (57)摘要 本发明公开了一种微生物菌剂， 具有活性成 分苏云金杆菌 FF05‑2和肠杆菌属05 ‑2， 苏云金杆 菌FF05‑2的DNA基因序列表如SEQ  ID NO.1所述； 肠杆菌属05 ‑2的DNA基因序列表如SEQ  ID NO.2 所述； 所述苏云金杆菌FF05 ‑2的分类名为 Bacillus  thuringien sis， 已保藏于中国微生物 菌种保藏管 理委员会普通微生物中心， 保藏日期 为2021年05 月17日 ， 保藏编号为CGMCC   NO .22542； 所述肠杆菌属05 ‑2的分类名为 Enterbacter  soli， 已保藏于中国微生物 菌种保 藏管理委员会普通微生物中心， 保藏日期为2 021 年05月17日， 保藏编号为CGMCC  NO.22541。 本发 明通过两种菌株的复合增强红薯中营养物质释 放和抑菌的能力， 从而有效抑制种薯中的病毒及 其他不良微生物的活动， 提高红薯苗的质量， 红 薯块根增产20%～40%； 利用茎尖组织培养， 大幅 度减少红薯育苗的原料使用量。 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图2页 CN 115232764 A 2022.10.25 CN 115232764 A 1.一种微生物菌剂， 其特征在于： 具有活性成分苏云金杆菌FF05 ‑2和肠杆菌属05 ‑2， 苏 云金杆菌FF05 ‑2的DNA基因序列表如SEQ  ID NO.1所述； 肠杆菌属05 ‑2的DNA基因序列表如 SEQ ID NO.2所述； 所述苏云金杆菌 FF05‑2的分类名为Bacillus  thuringien sis， 已保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏日期为2021年05月17日， 保藏编号 为CGMCC NO.22542； 所述肠杆菌属05 ‑2的分类名为Enterbacter  soli， 已保藏于 中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏日期为2021年05月17日， 保藏编号为CGMCC   NO.22541。 2.根据权利要求1所述的微 生物菌剂在红薯减毒苗中的应用。 3.根据权利要求2所述的应用， 其特 征在于， 具体步骤如下： 步骤一、 种薯选择和处理： 选取无病害虫斑的红薯为种薯， 装入容器内， 以微生物菌剂 发酵液浸没浸泡 一设定时间后， 取 出并将种薯至 于沙中直至发芽； 步骤二、 减毒苗： 红薯苗长到8～9片叶子时， 切取0.3～0.5mm的茎尖组织进行组织培 养， 获得携带 苏云金杆菌FF05‑2和肠杆菌属0 5‑2的减毒红薯苗； 步骤三、 减毒苗的病毒检测： 采用RT ‑PCR检测红薯中褪绿矮化病毒和羽状斑驳病毒， 减 毒苗中无两类病毒的检出； 步骤四、 减毒红薯苗的田间栽播： 减毒红薯苗长大后进行移栽， 在大田中生长到霜降前 进行红薯块 根的收获。 4.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于： 所述步骤一中， 微生物菌剂发酵液用自来 水稀释10倍， 种薯浸没入微生物菌剂的稀释液中， 浸泡30  min后取出； 所述步骤二中， 减毒 红薯苗中苏云金 杆菌FF05‑2和肠杆菌属0 5‑2的克隆数分别为1 ×107 cfu/g红薯苗。 5.根据权利 要求1所述的微生物菌剂， 其特征在于： 所述苏云金杆菌FF05 ‑2和肠杆菌属 05‑2用Ashby液体培养基培养， 苏云金杆菌FF05 ‑2和肠杆菌属05 ‑2的液体培养物按cfu比1: 2组成。 6.根据权利要求1所述的微生物菌剂， 其特征在于： 每1  ml中至少含有1 ×108 cfu苏云 金杆菌FF05‑2和肠杆菌属0 5‑2。 7.根据权利要求1所述的微 生物菌剂的制备 方法， 其特 征在于， 步骤如下： 步骤一、 采用Ashby固体培养基将苏云金杆菌FF05 ‑2和肠杆菌属05 ‑2活化， 并采用 Ashby液体培 养基进行培 养， 得到苏云金 杆菌FF05‑2和肠杆菌属0 5‑2的一级培 养菌； 步骤二、 将步骤一中培养得到苏云金杆菌FF05 ‑2和肠杆菌属05 ‑2的一级培养菌按cfu 比1:2进行混合， 按照10%的接种 量把混合菌液放入发酵液体培养基进行发酵培养， 在37℃ 条件下培 养10～12 h， 得到发酵的微 生物菌剂。 8.根据权利要求7所述的微生物菌剂的制备方法， 其特征在于： 所述步骤一中， 取出 ‑20 ℃条件下保存的苏云金杆菌FF05 ‑2和肠杆菌属05 ‑2， 分别用接种环蘸取少许菌液于Ashby 固体培养基上划线， 于37℃条件 下培养10～12  h； 用接种环挑取该固体培养基上的单菌落， 接种于Ashby液体培养基的100  mL三角瓶中， 于37℃条件下培养8~10 h得到活化的菌株； 此 时， 每毫升Ashby液体培 养基中至少含有1 ×108 cfu苏云金 杆菌FF05‑2和肠杆菌属0 5‑2。 9.根据权利要求7所述的微生物菌剂的制备方法， 其特征在于： 所述步骤二中， 发酵液 体培养基每升的组成及含量为：  MgSO4·7H2O 0.2g/L； NaCl  0.2g/L； 甘露醇  10g/L； K2HPO 4 0.2g/L； CaCO3 2.0g/L； 蛭石  2.0g/L； pH值6.4， 121℃灭菌15分钟。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115232764 A 2一种微生物菌剂 技术领域 [0001]本发明涉及一种微 生物菌剂， 属于农业栽培领域。 背景技术 [0002]红薯 （Ipomoea batatas(L.)， Sweet  Potato） 有营养丰富、 稳定性好、 产量高等优 点， 兼有粮食作物、 经济作物、 蔬菜作物和饲草作物的特点， 广泛种植于世界上100多个国 家， 本世纪甘薯将成为世界上第5大粮食能源供应植物。 红薯是我国重要的低投入、 高产出、 耐干旱、 耐瘠薄、 多用途的粮食、 饲料、 工业原料作 物和新型的生物能源作 物， 在我国仅次于 水稻、 小麦和玉米， 居第4位。 近年来， 市场对红薯的需求日益高涨， 种植面积不断扩大。 然 而， 病毒病是严重威胁红薯 生产的重要病害， 是导致红薯产量降低和种性退化的重要因素， 是红薯产业发展的重要限制因素。 [0003]如红薯羽状斑驳病毒(Sweet  potato feathery  mottle virus， SPFMV)在世界红 薯种植区均有发生， 严重影响红薯的产量和品质， 造成红薯产量损失可达  20%～30%， 严重 的可达50%以上。 红薯褪绿矮化病毒  (Sweet potato chlorotic  stunt virus， SPCSV)是危 害红薯的主要病毒之一，  且SPCSV可与SPFMV协生共侵染红薯引起红薯病毒病害SPVD   (sweet potato virus disease， SPVD)， 感染SPVD的红薯表现叶片扭曲、 畸形、 叶片褪绿、 明 脉以及植株矮化等症状， SPVD通常能使红薯减产50%～98%。 在田间， SPFMV可由蚜虫以非持 久性方式传播， SPCSV可由粉虱 以半持久性方式传播。 由于红薯是无性繁殖作物， 经病毒感 染便会在体内逐渐积累， 携带病毒随种薯、 种苗进行传播， 病毒通过薯块和薯苗不断累积， 随着无性繁殖代数增加导致带毒情况加重， 病害逐步加重， 从而增加了病毒病防治的难度。 当前防治红薯病毒病害， 主要以栽种脱毒红薯 苗、 加强栽培管理和选用抗病品种为主。 红薯 遗传上高度杂合、 种间种内杂交不亲和以及 多倍性， 红薯常规育种存在 诸多困难； 红薯病毒 种类繁多， 遗传变异快， 导致品种抗性易丧失。 因此， 开发与应用新型抗性技术成为红薯病 毒病防御的重要技 术保障。 [0004]最近几年， 生物 法防治病害日益受到重视。 益生菌可参与植物的防卫功能， 增强植 物抗逆境、 抗病毒、 抗动物危害的能力， 还可为植物提供氮源、 激素等营养物质。 植物益生菌 是生物防控制剂， 它们的代谢产物可防治病毒、 细菌、 真菌， 还可促进植物对N、 P、 K的吸收， 并能够防止非生物伤害等。 然而， 采用何种益生菌解决红薯种植存在的病毒病害问题， 以及 采用何种益生菌能具有好的抑菌效果和释放营养素来制备 红薯脱毒苗的育苗技术，