(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210894928.3 (22)申请日 2022.07.28 (71)申请人 桂林市威诺敦医疗器 械有限公司 地址 541004 广西壮 族自治区桂林市高新 区金鸡路挂子山科技园区 (72)发明人 韦朝宝　张凤玲　陶玉标　翟建鹏　 覃燚龙　陈碧炎　 (74)专利代理 机构 桂林文必达专利代理事务所 (特殊普通 合伙) 45134 专利代理师 张学平 (51)Int.Cl. C12N 15/01(2006.01) C12N 13/00(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12Q 1/689(2018.01)C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/225(2006.01) (54)发明名称 一种广谱抑菌罗伊氏乳杆菌的高效筛选、 诱 变优化方法 (57)摘要 本发明涉及微生物 技术领域， 具体涉及一种 广谱抑菌罗伊氏乳杆菌的高效筛选、 诱变优化方 法， 制备待测样本并用改良MRS培养基扩培， 用菌 液PCR扩增筛选阳性样本后进行平板划线和菌落 PCR扩增， 筛选 阳性罗伊氏乳杆菌菌落， 将阳性菌 落接种改良MRS培养基中的发酵液， 以大肠杆菌 及金黄色葡萄球菌为指示菌株， 检测发酵液对指 示菌株的抑菌效果； 选择对指示菌株有抑菌效果 的罗伊氏乳杆菌诱变优化后接种发酵液， 以大肠 杆菌、 金黄色葡萄球菌、 白色念 珠菌、 黑曲霉和铜 绿假单胞菌为指示菌株， 检测发酵液对指示菌株 的抑菌效果， 筛选对指示菌株都有抑制作用的罗 伊氏乳杆菌， 获得广谱抑菌罗伊氏乳杆菌， 该方 法分离速度快， 减少了试验周期。 权利要求书2页 说明书5页 附图3页 CN 115261376 A 2022.11.01 CN 115261376 A 1.一种广谱抑菌罗伊氏乳杆菌的高效筛选、 诱变优化方法， 其特征在于， 包括以下步 骤： 制备多个来源于无肠胃病史健康人群唾液与粪便的待测样本； 通过改良MRS培养基扩培各个待测样本， 并使用菌液PCR扩增所述待测 样本特异性筛选 出含有罗伊氏乳杆菌的阳性样本； 将所述阳性样本进行平板划线， 使用特异性引物进行菌落PCR扩增筛选出阳性罗伊氏 乳杆菌菌落； 将所述阳性菌落接种改良MRS培养基中的培养， 并以大肠杆菌及金黄色葡萄球菌为指 示菌株， 采用牛津杯抑菌圈法检测各个所述发酵 液对所述指示菌株的抑菌效果； 对上述所述指示菌株有的抑菌效果的罗伊氏乳杆菌进行诱变优化， 并将诱变后的菌落 接种至所述发酵液， 以大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌、 白色念珠菌、 黑曲霉和铜 绿假单胞菌为 指示菌株， 采用牛津杯抑菌圈法检测各个所述发酵液对所述指示菌株的抑菌效果， 筛选对 各个所述指示菌株都有抑制作用的罗伊氏乳杆菌， 获得广谱抑菌罗伊氏乳杆菌 。 2.如权利要求1所述的一种广谱抑菌罗伊氏乳杆菌的高效筛选、 诱变优化方法， 其特征 在于， 所述制备多个来源于无肠胃病史健康人群唾液与粪便的待测样本的具体方式： 将各个来源于无肠胃病 史健康人群唾液与粪便样本均接种于改良MRS培养基中， 37℃ 静置厌氧培 养20‑40h； 分别取各个培养液4ml进行离心， 5500rpm， 10min， 离心后的菌体用pH为6.8的无菌生理 盐水洗涤， 洗涤后再次进行离心， 6 000rpm， 8mi n， 重复两次， 得到无菌纯 水悬浮菌体； 将400uL的所述无菌纯 水悬浮菌体， 沸水浴10mi n， 10000rpm离心15mi n， 收集上清液。 3.如权利要求1所述的一种广谱抑菌罗伊氏乳杆菌的高效筛选、 诱变优化方法， 其特征 在于， 所述改良MRS培养基pH  7.2±0.2， 所述改良MRS培养基成分包括蛋白胨15.0g/L、 牛肉 膏15.0g/L、 酵母粉10.0g/L、 葡萄糖30.0g/L、 蔗糖15.0g/L、 硫酸镁1.0g/L、 乙酸钠5.0g/L、 柠檬酸三铵5.0g/L、 磷酸氢二钾5.0g/L、 硫酸锰0.1g/L和吐温80  1.0g/L。 4.如权利要求1所述的一种广谱抑菌罗伊氏乳杆菌的高效筛选、 诱变优化方法， 其特征 在于， 所述PCR扩增的反应体系为： 2 ×TaqPCR mix 10 μL， DDH2O 9 μL， 上游引物F10.4 μL， 下游 引物R10.4 μL和样本模板0.2 μL， 漩涡混匀后闪离5s， 置于PCR核酸扩增仪上反应， 所述PCR扩 增的反应条件为94℃预变性3min， 94℃变性10S， 55℃退火30S， 72℃延伸90S， 整个体系做28 个循环， 72℃后延伸5mi n。 5.如权利要求1所述的一种广谱抑菌罗伊氏乳杆菌的高效筛选、 诱变优化方法， 其特征 在于， 所述诱变优 化是用无菌生理盐将菌体稀释至105CFU/ml， 取200 μL涂布 于改良MRS琼脂培 养基平板上， 在紫外线杀菌灯下紫外诱变5 ‑20min， 避光37℃静置培养20 ‑40h， 挑选不大于 200个菌落的平板进行筛 选。 6.如权利要求1所述的一种广谱抑菌罗伊氏乳杆菌的高效筛选、 诱变优化方法， 其特征 在于，权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115261376 A 2所述菌液PCR扩增与菌落PCR扩增所用的特异性引物序列为SEQ  ID NO.1～2。 7.如权利要求1所述的一种广谱抑菌罗伊氏乳杆菌的高效筛选、 诱变优化方法， 其特征 在于， 所获广谱抑菌罗伊氏乳杆菌wndPL ‑14不仅可应用于调节肠道菌群、 预防和治疗腹泻 等多种肠道不适、 预防龋齿、 提高免疫力等， 其发酵产物还可应用于制作抑菌剂、 抗感染治 疗剂、 生物组织固定剂等， 用于食品和医疗行业。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115261376 A 3