(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210671589.2 (22)申请日 2022.06.14 (71)申请人 创芯国际生物科技 （广州） 有限公司 地址 510600 广东省广州市黄埔区开源大 道11号C3栋601室 (72)发明人 兰坚强　朱宇　井建玲　黄敏　 (74)专利代理 机构 广州容大知识产权代理事务 所(普通合伙) 44326 专利代理师 赵嬛嬛 (51)Int.Cl. C12N 5/071(2010.01) C12N 5/0787(2010.01) C12N 1/20(2006.01) C12R 1/19(2006.01) C12R 1/445(2006.01) (54)发明名称 一种子宫内膜炎症的类器官体外模型及其 建立方法和应用 (57)摘要 本发明涉及一种子宫内膜炎症的类器官体 外模型及其建立方法和应用， 包括： ①进行正常 组织的子宫内膜 类器官培养， 获得正常组织的子 宫内膜类器官； ②将获得的正常组织的子宫内膜 类器官传代培养3天； ③向步骤②所述的类器官 腔体中注 射细菌；④向步骤③获得的培养体系中 加入中性白细胞； ⑤向步骤④获得的培养体系中 加入10‑1,000ng/mL的LPS作为诱导试剂进行炎 症诱导。 本发 明方法通过在培养体系中添加使类 器官产生炎症的成分， 耗时少， 效率高， 适用范围 广， 可广泛用于 炎症模型的构建。 权利要求书1页 说明书6页 附图4页 CN 115125187 A 2022.09.30 CN 115125187 A 1.一种子宫内膜炎症的类 器官体外模型的建立方法， 其特 征在于， 包括： ①进行正常组织的子宫内膜类 器官培养， 获得正常组织的子宫内膜类 器官； ②将获得的正常组织的子宫内膜类 器官传代培 养3天； ③向步骤②所述的类 器官腔体中注射细菌； ④向步骤③获得的培 养体系中加入中性白细胞； ⑤向步骤④获得的培 养体系中加入10 ‑1,000ng/mL的LP S作为诱导试剂进行炎症诱 导。 2.根据权利要求1所述的一种子宫内膜炎症的类器官体外模型的建立方法， 其特征在 于， 还包括急性炎症模型鉴定： 利用qPCR方法鉴定TNF ‑a、 INF‑r、 IL‑1b的表达 。 3.根据权利要求1所述的一种子宫内膜炎症的类器官体外模型的建立方法， 其特征在 于， 所述步骤③中注射3‑8ul细菌。 4.根据权利要求1或3所述的一种子宫内膜炎症的类器官体外模型的建立方法， 其特征 在于， 所述细菌为大肠杆菌或金黄色葡萄球菌 。 5.根据权利要求1所述的一种子宫内膜炎症的类器官体外模型的建立方法， 其特征在 于， 所述步骤④中加入104‑106中性白细胞。 6.根据权利要求1所述的一种子宫内膜炎症的类器官体外模型的建立方法， 其特征在 于， 步骤①所述正常组织的子宫内膜类器官培养包括以下步骤： 将获得的子宫内膜标本经 过预处理得到细胞数量为30个细胞左右的细胞团； 将细胞团与Matrigel基质胶混匀后铺 板， 待凝固后倒置固定20 ‑30min； 加入子宫内膜类器官培养基， 于37℃、 5％CO2条件下培养 4‑7天， 期间每隔2 ‑3天更换一次培 养基。 7.根据权利要求1或4所述的一种子宫内膜炎症的类器官体外模型的建立方法， 其特征 在于， 步骤 ④所述中性白细胞 是通过血液中性白细胞分离提取获得的， 包括以下步骤： 将全血使用PBS1:1混匀后， 加入2倍体积的葡聚糖D extran T‑500并混匀， 置于4℃静置 40min后取上清按照质量比为1:1的比例加入PBS+Tris+HEPES缓冲液中， 于4℃， 500g离心 25min后弃上清； 使用PBS+Tris+HEPES缓冲液对沉淀进行清洗， 后加入裂红试剂， 沉淀与裂 红试剂的质量比为1:2， 使用HBS S清洗2次， 并重悬于DM EM中备用。 8.根据权利要求1或3所述的一种子宫内膜炎症的类器官体外模型的建立方法， 其特征 在于， 步骤 ③所述细菌是通过细菌培养扩增获得的， 包括以下步骤： 从 ‑70℃冰箱中取200 μl 感受态细胞悬液， 室温下使其解冻， 解冻后立即置冰上； 向管中加入1ml  LB液体培养基(不 含Amp)， 混匀 后37℃振 荡培养1小时， 使细菌恢复正常生长状态； 将上述菌液摇匀 后取100 μl 涂布于平板上， 正面向上放置半小时， 待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿， 37℃培养 16‑24小时； 从LB平板上挑取新活化的单个菌落， 接种 于3‑5ml LB液体培养基中， 37℃下振 荡培养12小时左右， 直至对数生长后期。 9.一种子宫内膜炎症 的类器官体外模型， 其特征在于： 是采用权利要求1～8任意一项 所述的方法建立。 10.权利要求9所述的子宫内膜炎症的类器官体外模型在研究细胞间相 互作用上的用 途。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115125187 A 2一种子宫内膜炎症的类器 官体外模型及其建立方 法和应用 技术领域 [0001]本发明涉及类器官培养技术领域， 具体涉及一种子宫内膜炎症的类器官体外模型 及其建立方法和应用。 背景技术 [0002]类器官(organoids)是一种利用成体干细胞体外培养出的具有3D结构的细胞培养 物， 与对应的人类器官拥有高度相似的组织学特征， 并能重现该器官的生理功能。 肿瘤类器 官(tumor oids)则是利用患者肿瘤组织体外培养的， 与患者肿瘤的结构、 生理等高度一致的 “微肿瘤”。 类器官可作为多种疾病的体外模 型， 在干细胞与发育、 再生医学、 疾病研究、 药物 开发和精准医疗等多个方面拥有广泛的应用前景。 类器官模型可以复制肿瘤的组织复杂性 与遗传异质性， 与诸多临床前模型如2D细胞系、 PDX模型等相比， 类器官在成功率、 维护难 度、 筛选难度上均表现出了良好的潜力， 为从基因或蛋白水平研究类器官致癌 或癌症相关 机制的研究提供宝贵的模型。 [0003]子宫内膜炎是指发生于子宫内膜的炎症， 常分为急性和慢性两种， 临床常见为急 性子宫内膜炎， 炎症使病原体较易入侵 宫腔内， 引发感染等造成严重的后果， 研究炎症机制 将有助于炎症疾病的治疗。 目前， 子 宫内膜炎症模 型建立方法已有报道， 而在3D 子宫内膜类 器官炎症模型尚未报道， 子宫内膜炎症类器官模型拥有多种细胞类型， 可以用于研究细胞 间相互作用等基础研究。 发明内容 [0004]有鉴于此， 有必要针对上述问题， 提供一种子宫内膜炎症的类器官体外模型及其 建立方法和应用。 [0005]为了解决现有技 术存在的问题， 本发明采用的技 术方案为： [0006]第一个方面， 本发明提供一种子宫内膜炎症的类 器官体外模型的建立方法， 包括： [0007]①进行正常组织的子宫内膜类 器官培养， 获得正常组织的子宫内膜类 器官； [0008]②将获得的正常组织的子宫内膜类 器官传代培 养3天； [0009]③向步骤②所述的类 器官腔体中注射细菌； [0010]④向步骤③获得的培 养体系中加入中性白细胞； [0011]⑤向步骤④获得的培养体系中加入10 ‑1,000ng/mL的LPS作为诱导试剂进行炎症 诱导。 [0012]进一步的， 还包括急性炎症模型鉴定： 利用qPCR方法鉴定TNF ‑a、 INF‑r、 IL‑1b的表 达。 [0013]优选的， 所述 步骤③中注射3‑8ul细菌。 [0014]优选的， 所述细菌为大肠杆菌或金黄色葡萄球菌 。 [0015]优选的， 所述 步骤④中加入104‑106中性白细胞。 [0016]进一步的， 步骤 ①所述正常组织的子宫内膜类器官培养包括以下步骤： 将获得的说　明　书 1/6 页 3 CN 115125187 A 3