(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211064274.8 (22)申请日 2022.08.31 (71)申请人 深圳市卫 光生物制品股份有限公司 地址 518107 广东省深圳市光明区光明街 道光侨大道3402号 (72)发明人 王雪云　何智敏　吴灼斌　郭土敬　 梁富　黄致翔　李慧　刘栩祥　 周维　周珊玄　罗姗　郭采平　 (74)专利代理 机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 专利代理师 李远星 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12P 21/00(2006.01) C07K 1/34(2006.01)C07K 1/18(2006.01) C07K 1/20(2006.01) C07K 1/36(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 一种大肠杆菌表达蛋白及其表达纯化方法 (57)摘要 本发明公开了一种大肠杆菌表达蛋白及其 表达纯化方法。 该方法包括以下步骤： (1)L ‑阿拉 伯糖诱导大肠杆菌蛋白表达， 其中， 在诱导表达 阶段， 用果糖、 麦芽糖和甘油作为碳源； (2)收获 菌体洗涤与匀质破碎； (3)表达蛋白的粗提取； (4)三步法柱层纯化蛋白， 在阳离子交换层析纯 化中引入表面活性剂TritonX ‑114。 本发明中， L ‑ 阿拉伯糖诱导阶段， 用果糖和麦芽糖等碳源替代 葡萄糖， 可以提高蛋白表达效率， L ‑阿拉伯糖对 于后期蛋白产品的安全性高于传统的IPTG； 连续 发酵连续收获的发酵方法， 提高了最终收获的菌 体量和产物量； 采取超滤法粗提蛋白产物， 有效 缓解多次离心所带来的污染风险， 柱层纯化引入 表面活性剂 Triton X‑114， 可以提高蛋白纯度且 有效降低内毒素含量。 权利要求书2页 说明书5页 附图2页 CN 115491328 A 2022.12.20 CN 115491328 A 1.一种大肠杆菌表达蛋白的表达纯化方法， 其特 征在于， 其包括以下步骤： (1)L‑阿拉伯糖诱导大肠杆菌蛋白表达， 其中， 在诱导表达阶段， 用果糖、 麦芽糖和甘油 作为碳源， 接着采用连续发酵 连续收获的灌流法进行培 养； (2)收获菌体洗涤与 均质破碎； (3)表达蛋白的粗 提取： 采用超滤浓 缩方式对蛋白产物进行粗 提； (4)三步柱层析法纯化蛋白： 分别采用阴离子交换层析柱， 疏水及阴离子复合层析柱， 阳离子交换层析柱进行精纯。 在阳离 子交换层析 纯化中引入表面活性剂Trito nX‑114。 2.根据权利要求1所述的大肠杆菌表达蛋白的表达纯化方法， 其特征在于， 所述L ‑阿拉 伯糖诱导终浓度0.3 ‑2mg/ml。 3.根据权利要求1或2所述的大肠杆菌表达蛋白的表达纯化方法， 其特征在于， 所述步 骤(1)具体是指： 采用灌流培养及连续收获的方式， 在上罐培养到大肠杆菌达到对 数期后诱 导蛋白表达， 之后采用含L ‑阿拉伯糖灌流液进行灌流培 养。 4.根据权利要求3所述的大肠杆菌表达蛋白的表达纯化方法， 其特征在于， 所述连续培 养中收获出 液量流速控制每分钟10 0‑300ml， 收集 流出菌体。 5.根据权利要求3所述的大肠杆菌表达蛋白的表达纯化方法， 其特征在于， 诱导前发酵 培养基葡萄糖终浓度为0.2 ％‑2％(W/V)； 所述灌流液中果糖浓度20％ ‑40％(W/V)， 麦芽糖 浓度10％ ‑30％(W/V)和甘油5％ ‑10％(W/V)。 6.根据权利要求1、 2或5所述的大肠杆菌表达蛋白的表达纯化方法， 其特征在于， 所述 三步法柱层析纯化是指： 阴离子交换层析柱是指： DEAE  Sepharose  FF、 Q sepharose  FF、 capto Q、 Capto Q Impres层析等， 优选的阴离子交换层析柱为DEAE  sepharose FF层析纯 化。 疏水及阴离子复合层析柱是指： Capto  adhere ImpRes， Capto  adhere， NM90  AgaroseTM  HCM层析等， 优选Capto  adhere ImpRes层析纯化。 阳离子交换层析柱是指： CM  Sepharose   Fast Flow， CM Sepharose  High Performance， Capto  S ImpAct， S P Sepharose  FF层析等。 7.根据权利要求6所述的大肠杆菌表达蛋白的表达纯化方法， 其特征在于， 阴离子交换 层析纯化方法为： 采用含10 ‑50mM的硼酸钠硼酸缓冲液， pH  8.5‑9.5平衡5 ‑10个柱体积后上 样， 上样结束后， 采用上述硼酸 缓冲液继续冲洗阴离子交换柱5 ‑10个柱体积， 并用含有0.2 ‑ 0.5M Nacl的硼酸钠 ‑硼酸缓冲液(pH8.5 ‑9.5)进行洗脱， 收集洗脱峰1， 并用于下一 步层析。 8.根据权利要求6所述的大肠杆菌表达蛋白的表达纯化方法， 其特征在于， 疏水及阴离 子复合层析柱纯化方法为： 权利要求7中所得洗脱峰1液采用含20 ‑50mM磷酸缓冲液pH(6.5 ‑ 7.2)的平衡缓冲液稀释2 ‑5倍， 并用6M的盐酸将pH调节至6.5 ‑7.2。 用此平衡缓冲液平衡层 析柱3‑5个柱体积后进行上样。 上样结束并冲平后， 采用0.05 ‑0.15M醋酸的洗脱缓冲液进行 洗脱， 收集洗脱峰2。 9.根据权利要求6所述的大肠杆菌表达蛋白的表达纯化方法， 其特征在于， 阳离子交换 层析纯化方法为： 权利要求8中所得洗脱峰2采用含0.05 ‑0.15M醋酸、 10 ‑50mM Na2HPO4和 0.2％‑2％Trinton  X‑114的平衡缓冲液稀释1 ‑3倍， 并用此平衡缓冲液平衡5 ‑10个柱体积 后， 上样， 上样结束并冲平后， 采用10 ‑50mM Na2HPO4溶液洗10 ‑20柱体积， 待流出端pH值在 2.0‑3.0范围内后， 采用10 ‑50mM Na2HPO4溶液进行洗脱， 并收集洗脱峰， 即为纯化后产品， pH 值最终约为7.0 ‑8.0。 10.一种大肠杆菌表达蛋白， 其特征在于， 其通过如权利要求1 ‑9任一所述的大肠杆菌权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115491328 A 2表达蛋白的表达纯化方法纯化获得。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115491328 A 3