(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210963807.X (22)申请日 2022.08.11 (71)申请人 华中科技大 学 地址 430074 湖北省武汉市洪山区珞喻路 1037号 (72)发明人 吕斌　宋暖　谭多　 (74)专利代理 机构 华中科技大 学专利中心 42201 专利代理师 孙杨柳 (51)Int.Cl. H01F 1/00(2006.01) H01F 41/00(2006.01) B01J 13/02(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01)C12Q 1/04(2006.01) (54)发明名称 一种多功能磁性纳米微球及制备和应用 (57)摘要 本发明涉及一种多功能磁性纳米微球及制 备和应用， 属于细菌分离和富集领域。 本发明在 氨基化磁性纳米微球(MNP‑NH2)表面首先修饰聚 多巴胺(PDA)壳层后， 连接长链聚乙二 醇(PEG)分 子臂， 然后在分子臂上修饰抗生素多粘菌素B (PMB)得到MNPPDA‑PEG‑PMB。 PMB具有广谱细菌结合 特性， 但对G‑的结合能力更强。 在MNP ‑NH2表面修 饰PDA可提高MNP表面的活性基团数量， 提高其所 结合PMB的含量； 长链PEG有助于减少MNP与细菌 结 合时的 空 间 位阻 ， 两 者 结 合 最 终 提高 MNPPDA‑PEG‑PMB的吸附容量。 吸附了细菌的 MNPPDA‑PEG‑PMB微球， 可直接加入固体和液体培养 基中进行培养， 快速检测细菌活性。 MNPPDA‑PEG‑PMB 联合热裂法可应用于复杂样品中系列细菌核酸 快速检测。 权利要求书1页 说明书9页 附图11页 CN 115376772 A 2022.11.22 CN 115376772 A 1.一种多粘菌素功能化磁性纳米微球， 其特征在于， 所述多粘菌素功能化磁性纳米微 球为氨基化磁性纳米微球表面修饰聚多巴胺壳层、 聚乙二醇分子臂和多粘菌素B； 所述聚多 巴胺壳层包覆氨基化磁性纳米微球； 所述聚乙二醇两端修饰有醛基， 且两端的醛基分别与 聚多巴胺壳层和多粘菌素B上的氨基连接 。 2.如权利要求1所述的多粘菌素功能化磁性纳米微球， 其特征在于， 所述氨基化磁性纳 米微球为氨基化的四氧化 三铁纳米微球或氨基化的三氧化 二铁纳米微球。 3.如权利要求1或2所述的多粘菌素功能化磁性纳米微球的制备方法， 其特征在于， 在 氨基化磁性纳米微球表面， 修饰聚多巴胺壳层后， 依 次连接分子臂聚乙二醇和多粘菌素B； 所述分子臂聚乙二醇两端修饰有醛基， 且两端的醛基分别与聚多巴胺壳层和多粘菌素B上 的氨基连接 。 4.如权利要求3所述的多粘菌素功能化磁性纳米微球的制备方法， 其特征在于， 具体包 括以下步骤： (1)在氨基化磁性纳米微球上修饰聚多巴胺壳层： 将氨基化磁性纳米微球、 多巴胺盐酸 盐和乙二胺混合， 生成的聚多巴胺包覆在氨基化磁性纳米微球表面； (2)修饰聚乙二醇分子臂： 将步骤(1)得到的中间产物中加入两端修饰有醛基的聚乙二 醇， 该醛基与聚多巴胺上的氨基发生醛氨缩合反应； (3)修饰多粘菌素B： 将步骤(2)得到的中间产物中加入多粘菌素B， 充分混匀， 随后加入 氧化还原催化剂， 使聚乙二醇上的醛基与多粘菌素B上的氨基发生醛氨缩合反应， 得到多粘 菌素功能化磁性纳米微球。 5.权利要求4所述的多粘菌素功能化磁性纳米微球的制备方法， 其特征在于， 步骤(1) 中， 所述氨基化磁性纳米微球为氨基化的四氧化三铁纳米微球或氨基化的三氧化二铁纳米 微球。 6.如权利要求1或2所述的多粘菌素功能化磁性纳米微球的应用， 其特征在于， 用于吸 附细菌。 7.如权利要求6所述的应用， 其特征在于， 吸附不同样品中的革兰氏阴性菌和/或革兰 氏阳性菌 。 8.如权利要求6所述的应用， 其特征在于， 所述多粘菌素功能化磁性纳米微球联合另一 种磁性纳米微球用于吸附各种样品中的革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌； 所述另一种磁 性纳米微球为羧基化的磁性纳米微球表面修饰聚乙二醇和万古霉素， 该聚乙二醇两端为氨 基修饰， 并分别与羧基化的磁性纳米微球和万古霉素 连接。 9.如权利要求6所述的应用， 其特征在于， 吸附细菌之后， 再运用热裂法提取多粘菌素 功能化磁性纳米微球结合细菌的核酸， 然后用于qPCR检测， 以提高核酸鉴定的灵敏度和 检 测速度， 从而实现样品中细菌核酸的快速鉴定 。 10.如权利要求6所述的应用， 其特征在于， 吸附细菌之后， 所述多粘菌素功能化磁性纳 米微球不影响所吸附细菌的活性， 将吸附了细菌的多粘菌素功能化磁性纳米微球直接加入 固体或液体培 养基中进行培 养， 以实现快速检测细菌活性。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115376772 A 2一种多功能磁性纳米微球及制备和应用 技术领域 [0001]本发明属于细菌分离和富集领域， 更具体地， 涉及一种高效靶向分离和富集细菌 的多粘菌素B功能化磁性纳米微球及制备和应用。 背景技术 [0002]据世界卫生 组织(WHO)统计， 致病性细 菌感染每年可能造 成1330万人死亡， 对全世 界公共卫生安全构 成极大威胁(Analyst,2012,137(15):3405 ‑3421)。 致病菌种类繁多， 感 染途径多样， 治疗药物众多， 建立病原菌快速、 精确检测方法， 有助于更好地预防并治疗细 菌感染(M ater Chem B,2017,5(44):8631 ‑8652)。 病原菌检测包括活性检测和核酸检测两 大方面。 由于实际样品中的细菌含量不一， 且其中的蛋白质、 脂肪、 酶反应抑制剂、 离子等， 均可影响细菌活性和核酸检测的灵敏度和准确 性， 往往需要从样本中分离富集靶细菌后， 再进行活性和核酸检测， 以保证检测的灵敏度、 准确性和可靠性(Biosens  and  Bioelectron,2011,2 6(11):4368 ‑4374)。 因此， 开发简单快速方便， 且可同时用于细菌活性 和核酸快速检测的细菌分离富 集材料和方法十分必要。 [0003]常用的病原菌富集方法主要包括选择性培养法、 物理法和生物亲和法。 细菌选择 性培养富集仅针对 特定细菌， 通常需要2 ‑4天时间， 耗时长， 无法实现快速检测； 物理方法主 要有离心、 过滤、 超滤等， 需要仪器设备基础， 且它们更适用于细菌种群筛查， 若进 行特定细 菌富集则特异性不够。 而生物亲和法是利用细菌和固相载体上亲和分子之 间的亲和作用实 现分离， 是一种温和、 高效、 简单的细菌分离富集方法。 其中， 磁性纳米微球MNP(Magnetic   nanoparticle， MNP)具有超顺磁性， 便于利用磁场进行分离操作， 克服了其他纳米材料难以 从样本基质中分离的问题。 MNP具有高吸附容量， 表面易于连接各种功能化基团， 适合用于 制备生物亲和材料。 修饰MNP的识别分子中， 抗体特异性强， 但也有诸多缺点， 如价格昂贵， 所需孵育时间长， 稳定性差等； 生物大分子功能基团众多， 在修饰过程中三 维结构变性和随 机分子取向可能使其生物活性下降； 有机/无机分子通常为非特异性吸附， 缺乏选择性。 小 分子抗生素对细菌具有选择性靶向作用， 稳定性好， 适合作为亲和分子。 抗生素多粘菌素B (Polymyxin  B， PMB)具有广谱细菌吸附性能。 PMB侧链氨基与G‑外膜脂多糖脂质A的磷酸基 团发生静电结合， 同时第6、 7位氨基酸和脂肪酰基侧链与脂质A的脂肪酸部 分发生疏水相互 作用， 其对G‑的作用更强(见图1)， 因此PMB在不同样本中对G‑和G+菌的特性有一定差异， 但 呈现较强的G‑靶向作用， 价格便宜， 适合用于制备样品预处理所用的功能化MNP。 先前关于 PMB的研究集中在抗菌领域(Sci  Adv,2021,7(32)： eabj1577)， 这限制了其在细菌吸附和细 菌活性检测中的应用。 此外， 纳米颗粒间的空间位阻效应会降低细菌的吸附容量。 因此， 提 高PMB功能化纳米微球的生物兼容 性和降低其空间位阻效应是需要解决的难题。 [0004]聚多巴胺(PDA)由多巴胺自聚合所制备， 具有大量亲水性羟基和氨基， 具有良好的 生物兼容性。 MNP表 面修饰PDA壳层既可以提供后续修饰所需的活性基团， 又防止MNP与生物 系统直接接触， 提高MNP的生物相容性， 这有助于解决PMB的细菌毒性的难题。 聚乙二醇 (PEG)是一种具有良好水溶性和生物相容性的线性长链高分子聚合物， 具有多样功能基团。说　明　书 1/9 页 3 CN 115376772 A 3